人外周淋巴细胞的应用

背景^[1-3]

人外周淋巴细胞简称PBL，主要是血液循环中的淋巴细胞，主要由T细胞(占70%～80%)和B细胞(占20%～30%)组成。

通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂细胞的，只有在异常情况下才能发现。外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。体外培养时经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。外周血中的淋巴细胞经过68-72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。

人外周淋巴细胞

人外周淋巴细胞原代分离步骤:

1)抽取人的外周血于肝素抗凝管中，取足5mL新鲜血液，加入PBS按1：1稀释血液（一般采血管2mL+2mL）。

2)取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用。

3)吸取稀释血液，在离分层液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，并与分离液形成明显界面。

4)室温，离心2000rpm，20min。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状。

5)小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞。加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500rpm，10min。

6)去上清液，加入1640培养基1mL混匀，取少量进行细胞计数。

7)用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性：取2滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，5-10min后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。计数200个细胞，计算活细胞百分率，活性应在95％以上。

应用^[4][5]

用于成人急性及慢性活动性Epstein-Barr病毒感染外周血淋巴细胞亚群改变特点分析研究

探究急性EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染（传染性单核细胞增多症,infectious mononucleosis,IM）及慢性活动EBV感染（chronic active EBV infection,CAEBV）患者外周血淋巴细胞亚群特点,分析比较其免疫功能差异。

方法：收集IM患者急性期、随访1月及6月时外周血标本,收集CAEBV患者及健康对照组（healthy controls,HC）外周血标本,流式细胞术测定外周血淋巴细胞亚群CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞（natural killer,NK）和B细胞计数及比例,辅助性T细胞亚群比例,T及NK细胞激活水平,增殖水平,以及PD-1表达水平,分析IM患者病程中淋巴细胞亚群变化特点,综合评估其免疫系统功能。

结果：IM患者10例,完成1月随访6例,完成6月随访5例;就诊于北京协和医院的CAEBV患者6例,健康对照者10例。

相比HC组,IM患者急性期CD8+T细胞计数（×106/L）和比例（IM vs.HC 3706.32±1433.70,68.1±11.6%vs.553.30±112.00,26.3±5.3%,p<0.0001）显著增加,记忆CD4+T细胞比例明显上升（76.0±9.6%vs.51.3±11.9%,p<0.0001）,T细胞激活水平显著增加（CD38+CD8+T:88.3±8.0%vs.14.7±10.5%,p<0.0001;HLA-DR+CD8+T,77.7±7.7%vs.11.0±5.9%,p<0.0001）,CD8+T细胞增殖水平显著升高（Ki67+CD8+T:23.6±10.3%vs.1.0±2.4%,p<0.0001）,T细胞PD-1表达水平显著升高（PD-1+CD4+T:34.7±11.1%vs.11.6±4.4%;PD-1+CD8+T:31.2±13.6%vs.11.8±6.3%,p<0.0001）,1月后随访所有患者症状均消失,淋巴细胞亚群基本恢复正常。

CAEBV患者淋巴细胞亚群计数较HC组显著下降,记忆CD4+T细胞比例轻度上升（CAEBV vs.HC 72.2±24.2%vs.51.3±11.9%,p=0.0186）,T细胞激活水平略有上升（CD38+CD8+T:45.5±23.7%vs.14.7±10.5%,p<0.0001;HLA-DR+CD8+T,51.6±21.6%vs.11.0±5.9%,p<0.0001）,Ki67+表达水平与对照组无明显差异,T细胞PD-1表达水平明显上升（PD-1+CD4+T:33.6±14.3%vs.11.6±4.4%,p=0.0101;PD-1+CD8+T:31.2±19.4%vs.11.8±6.3%,p=0.0412）。

IM和CAEBV患者淋巴细胞亚群比较,CD8+T细胞计数及激活水平具有显著差异（IM vs.CAEBV,计数3706.3±1433.7 vs.124.3±83.5,p<0.0001 CD8+CD38+:88.3±8.0%vs.45.4±23.7%,p<0.0001;CD8+HLA-DR+:77.7±7.7 vs.51.6±21.6,p=0.0093）。

参考文献

[1]Henry H Balfour,Samantha K Dunmire,Kristin A Hogquist.Infectious mononucleosis.[J].Clinical&translational immunology,2015,4(2).e33.

[2]Chi Young Ok,Ling Li,Ken H Young.EBV-driven B-cell lymphoproliferative disorders:from biology,classification and differential diagnosis to clinical management.[J].Experimental&Molecular Medicine,2015.47e132.

[3]Paul Lennon,Michael Crotty,John E Fenton.Infectious mononucleosis.[J].BMJ(Clinical research ed.),2015.350h1825.

[4]Gottschalk S,Fowler D,Bishop MR,et al.Characterization and treatment of chronic active Epstein-Barr virus disease:a 28-year experience in the United States.[J].Blood:The Journal of the American Society of Hematology,2011,117(22).

[5]王赫男.成人急性及慢性活动性Epstein-Barr病毒感染外周血淋巴细胞亚群改变特点分析[D].北京协和医学院,2020.