维生素B12的药理作用及应用

【背景及概述】^[1][2][3]

维生素B12又称钴胺素，B 族维生素之一，主要存在于动物性食品，如内脏、肝、肾和猪心等，瘦肉、鱼、牛乳以及蛋黄也存在维生素B12 ；植物中不含维生素B12 ，放线菌、人和动物的肠道菌能合成维生素B12 ，结构上是一类含的复杂有机化合物，所含的三价钴位于类似卟啉的咕啉环平面的中心。自然界中的维生素B12有五种左右的类似物，主要是分子中与Co 连接的基团不同，分别为-CN 、-OH、-CH₃ 、-NO₂ 和H₂O ，它们具有相同的生理活性。

维生素B12以辅酶形式参与各种代谢过程，促进甲基的形成和转移，参与某些化合物的异构化作用、维持SH 基的还原状态，促进DNA 和蛋白质的合成，促进细胞的成熟，维持神经组织的正常功能，缺乏维生素B12时会发生恶性贫血、神经系统的损害等，临床上可用于治疗恶性贫血、肝脏疾病、神经炎、神经痛等，在饲料工业上，也用于促进猪、鸡等牲畜的生长。维生素B12作为一种人体和动物必需的维生素，其独特的功能性及其复杂的结构和产生条件决定了其较为苛刻的生产条件，正是这种不易获得性使其价格非常昂贵，目前国际市场的报价为：97 %的维生素B12的价格为4 ，5000RMB/Kg 。多年来，人们一直在尝试通过化学成的途径来降低维生素B12的成本，但由于其庞大而复杂的结构，虽在近些年已获得成功，但同时使化学家们陷入了新的困境：副产物太多，难以提纯。于是，人们又重新审视维生素B12的生产方法，再次将重点转向发酵法生产，能产生维生素B12的菌种较多，但由于其作为次级代谢产物，始终在发酵水平没有新的突破，在国内，仅近年才出现了两个生产厂家，但其年产量总共不足两吨，与庞大的国内需求市场微不足道，目前国内市场上食用及药用维生素B12的90 %以上依靠进口，因此，在国内实现维生素B12的低成本化，将会有巨大的市场潜力。

【理化性质及结构】^[1]

维生素B12为深红色结晶体，熔点甚高(320 ℃时不熔)，无臭无味，溶于水、乙醇和丙酮，不溶于氯仿、丙酮和乙醚，结构性质相当稳定；在中性溶液中耐热、酸、碱，日光、氧化剂和还原剂均能使其破坏。

【制剂规格】^[4]

注射剂：1mL∶50μg；1mL∶100μg；1mL∶250μg；1mL∶500μg；1mL∶1000μg。 pH(100～1000μg/mL)：3.5～5.5。

【药理作用及应用】^[4]

抗贫血药。用于巨幼细胞性贫血，也可用于神经炎的辅助治疗。

【用法用量】^[4]

肌注，治疗维生素B12缺乏症，起始一日25～100μg 或隔日50～200μg，共2周；如伴有神经系统表现，一日用量可增加至500μg。以后每周肌注2次，每次50～100μg，直到血象恢复正常；维持量每月肌注100μg。亦可做深部皮注。

【不良反应】^[4]

偶可引起皮疹、瘙痒、腹泻及过敏性哮喘，极个别有过敏性休克；可引起低血钾及高尿酸血症。维生素B12静注曾有致死报道。

【禁忌/慎用证】^[4]

对本药过敏、家庭遗传性球后视神经炎及抽烟性弱视症者禁用。

【注意事项】^[4]

1. 静脉给药后会迅速从尿排出，且有致死案例故禁忌静脉给药；

2. 大剂量维生素B12治疗巨幼细胞性贫血，在起始48h 宜查血钾有无下降；

3. 抗生素可影响血清和红细胞内维生素B12 测定，特别是应用微生物学检查方法，可产生假性低值。

【制备】^[1][2]

1. 生产菌种：

2.生物合成：

3. 发酵生产：

1）抗生素废液中提取：早在1952 年美国T .R.Wood 等人就发现，当用加有钴化合物的培养基培养灰色链霉菌时，可大大提高维生素B12在整个培养液中的浓度，但是对于钴化合物的浓度要求要适量，过高的浓度会对菌体细胞产生毒性；另有研究表明，添加适量的氰化合物也同样可促进抗生素废液中B12 类似物的含量，但需严格掌握其用量。

2）放线菌发酵：自从人们发现可从抗生素废液中提取得到维生素B12后，许多科学家将目光转向了采用放线菌，其中主要是链霉菌属中的灰色链霉菌和橄榄色链霉菌来发酵产维生素B12 ，而于链霉素的生成，而始终未能使得维生素B12的产生处于主导地位，因此，应选出链霉素发酵支路的关键酶，并将其抑制，这样便可大大提高维生素B12的得率，使得大量产生维生素B12成为可能。

3）下水道废液中提取：采用生物活性污泥法处理的废水中，通常含有多的B12，干的活性污泥可先用水浸提，然后过滤掉固形颗粒，之后可分离、纯化B12，由此得到的B12有如下特点：无需前培养，这样大大减少了前期投入；能耗大，尤其是浓缩这一关键性步骤将造成大的能量损耗；用此法得到的B12的浓度虽并不低，但受活性污泥这一来源的影响，由此获得的B12并不能直接进入食品或药品级产品，而通常只局限于饲料添加剂。

4）丙酸菌发酵：丙酸菌，例如Propionibacterium freudenreichii 和Propionibacteriumshermanii 常用作B12 的产生菌，这类细菌常采用厌氧发酵，采用丙酸菌发酵的特点：在于培养基在发酵过程中，产生丙酸菌而使得培养基PH 下降，从而可避免杂菌的污染；因为是厌氧发酵，勿需设计供氧系统和搅拌系统，可减少设备投入和节约能耗；随着发酵过程丙酸钙的产生，而丙酸钙通常是用作防霉和防腐添加剂的，从而可进一步减少染菌的可能性。

5）由巨大芽孢杆菌生产B12：以巨大芽孢杆菌为例，将培养基用氨水调至pH7 .0，发酵液需要连续不停地搅拌和大量通气，温度需控制在30 ℃左右，每隔一定时间需用5 %的氨水来调pH，同时需定期补充碳、氮源，以期达到最高产量。

6）采用转基因的E .Coli .发酵生产：目前，人们对于B12的控制基因已经非常清楚，因此，这就使得将其转入大肠杆菌，以期大量生产，但该方法真正用于大生产还有待时日，即使用于生产，也会不可避免地存在这样的问题，如导入的质粒不能稳定地遗传下去，会随发酵条件的变化而脱落等，因此，就近些年，维生素B12 的生产仍需按传统发酵来完成。

【测定】^[1][2]

1.  比色测定法

本法是药物样品中维生素B12 测定的常用方法。其原理是样品经浓硫酸和高氯酸钾消化后，样液中的钴与M -二-(α-吡啶酮)-α-吡啶联腙生成钴的红色化合物，可以进行比色测定，再从钴的含量换算成维生素B12的含量。

2.  离子交换测定法

药物中的维生素B12可以从弱酸性阳离子交换树脂中得到，分离洗脱下来。例如，桔子酱中的维生素B12通过Florisi 土为吸咐剂进行层析分离后，在530nm 波长处测定其含量。

3.  原子吸收法

维生素B12的分子中含有钴原子，占维生素B12的4 .35 %，采用原子吸收分光光度法可以测定其中的钴含量，再换算成维生素B12 含量。在测定药品中维生素B12时，可以直接将药品的溶液吸入原子分光光度计中测定。但用于测定食品中的维生素B12时，先将样品预先处理，样品用提取剂提取，于滤液中加入5 .0g EDTA ，用NH4OH 调节至pH7 .0 ，再加入5g 活性炭，振摇，用无灰滤纸过滤，维生素B12被吸附在活性炭上，将活性炭连同滤纸一起在600 ℃下灰化完全，用5mol/L 的硝酸将残渣溶解，然后用原子吸收分光光度法测定钴的含量，本法与微生物法结果一致。

4.  微生物法

原理同微生物学浊度法，试验菌种采用乳酸酐菌Leichmannii(ATCC 7830)，灵敏度>20ng/Kg 。

【主要参考资料】

[1] 罗祎, 郝常明. 维生素 B12 的研究及其进展[J]. 中国食品添加剂, 2002 (3): 15-18.

[2] 谢丽华. 维生素 B12 的技术进展[J]. 河北化工, 2011, 34(1): 23-26.

[3] 张玉明, 王雷, 王云山, 等. 维生素 B12 的生物合成研究[J]. 食品与发酵工业, 2005, 31(9): 70.

[4] 452种注射剂安全应用与配伍