C666-1细胞的应用

背景^[1-3]

C666-1细胞是EBV阳性鼻咽癌细胞系，是来源于阳性鼻咽癌的上皮细胞样贴壁细胞。培养条件为RPMI-1640+10%FBS+1%双抗，生长条件为气相：5%CO2；95%空气温度：37℃。

C666-1细胞

培养步骤：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中，加入约6ml培养基，培养过夜），第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养瓶中上清液，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2

分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻

敲几下培养瓶后加6ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散。

3.吹打匀后吸出，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：4的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中。

应用^[4][5]

用于miR-9下调CXCR4抑制鼻咽癌增殖、侵袭和转移的作用及机制研究

通过5-AZA和TSA处理C666-1细胞后检测miR-9的表达变化和相应编码基因的甲基化状态变化,进而研究miR-9在鼻咽癌中表达失调是否与相应的编码基因启动子区CpG岛DNA甲基化相关,明确miR-9表达失调的分子机制。

通过筛选miR-9过表达的C666-1细胞和体内外功能实验,明确miR-9对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭和转移的影响；通过构建和miR-9结合的CXCR4 3’-UTR双荧光报告质粒及上述体内外功能实验,探讨miR-9和CXCR4之间是否存在直接的靶向调控关系,miR-9能否部分逆转CXCR4在鼻咽癌中的生物学功能；

方法1.临床标本收集和分组收集鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织,共60例,包括40例鼻咽癌组织（其中无转移者20例,伴转移者20例）和20例慢性鼻咽炎组织（对照组）,患者临床资料齐全,所有标本均行HE染色确诊,同时行miR-9原位杂交检测,并分析其表达与患者临床资料之间的相关性。

2. 鼻咽癌细胞株的培养鼻咽癌细胞C666-1、Sune-1、5-8F、6-10B、CNE-1、CNE-2和Hone-1以RP1640+10%FBS培养,正常的永生化鼻咽上皮细胞NP69以KMSF培养基培养,按常规条件消化传代。

3. Real time-PCR:抽提细胞内小分子RNA和总RNA,逆转录成cDNA后利用Taqman探针或引物进行PCR扩增,以2-ΔΔCt值表示基因相对表达强度。

4. 原位杂交：石蜡组织和细胞爬片经组织脱蜡和水化（4%多聚甲醛固定）、胰酶消化（细胞透化）、预杂交、杂交、封闭、抗地高辛标记的一抗（1：1000）4℃孵育过夜、BCIP/NBT缓冲液洗涤、BCIP/NBT染色、核固红复染、封片等步骤后,显微镜下观察染色结果,并进行结果判读,判定标准同免疫组化结果的判读。

5.去甲基化药物5-AZA和去乙酰化药物TSA处理C666-1细胞将鼻咽癌细胞C666-1以1×105的密度接种于6孔板中,生长过夜后加入终浓度为50uM的5-AZA,每隔24小时换含上述浓度的5-AZA的完全培养基一次,连续处理3天后收集细胞（5-AZA组）,或在连续加入终浓度为50uM的5-AZA作用3天后继续加入终浓度为10nm的TSA维持作用24小时后收集细胞（5-AZA+TSA组）,检测miR-9的表达变化和miR-9编码基因的甲基化状态变化。

参考文献

[1]MicroRNA-9 Reveals Regional Diversity of Neural Progenitors along the Anterior-Posterior Axis[J].Boyan Bonev,Angela Pisco,Nancy Papalopulu.Developmental Cell.2011(1)

[2]Methylation of HPV16 genome CpG sites is associated with cervix precancer and cancer[J].Chang Sun,Laura L.Reimers,Robert D.Burk.Gynecologic Oncology.2011(1)

[3]MicroRNA-26b is underexpressed in human breast cancer and induces cell apoptosis by targeting SLC7A11[J].Xiao-Xiao Liu,Xiao-Jun Li,Bo Zhang,Yong-Jun Liang,Ci-Xiang Zhou,Dan-Xia Cao,Ming He,Guo-Qiang Chen,Jian-Rong He,Qian Zhao.FEBS Letters.2011(9)

[4]Restoration of miR-517a expression induces cell apoptosis in bladdercancer cell lines[J].Takayuki Yoshitomi,Kazumori Kawakami,Hideki Enokida,Takeshi Chiyomaru,Ichiro Kagara,Shuichi Tatarano,Hirofumi Yoshino,Hiroshi Arimura,Kenryu Nishiyama,Naohiko Seki,Masayuki Nakagawa.Oncology Reports.2011(6)

[5]罗花南.miR-9下调CXCR4抑制鼻咽癌增殖、侵袭和转移的作用及机制研究[D].南方医科大学,2011.