大鼠胰岛素瘤细胞INS-1的应用

背景^[1-3]

大鼠胰岛素瘤细胞INS-1源自X射线照射的移植胰岛瘤的大鼠，胰岛素阳性，可合成胰岛素原I和II，可用于beta细胞功能研究。

大鼠胰岛素瘤细胞INS-1

培养步骤

培养基及培养冻存条件准备：

准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,货号21875-091)，90%；优质胎牛血清，10%，添加50μmol/Lβ－巯基乙醇。

培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

细胞处理：

复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

用于糖耐康对糖脂毒性诱导的胰岛细胞株INS-1损伤的保护作用研究

通过体外培养胰岛β细胞INS-1糖脂毒模型,用“益气养阴清热”糖耐康进行分组干预,观察糖耐康对糖脂毒下的胰岛β细胞活力、凋亡以及胰岛素分泌的影响,并进一步从胰岛β细胞胰岛素信号转导通路探讨糖耐康对PI3K/Akt下游FOXO1等因子的影响,探索其具体作用靶点。为中药治疗糖脂毒诱导的早期2型糖尿病提供理论依据。

方法：1.糖耐康含药血清对糖脂毒损伤的INS-1细胞活力的影响体外选用大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1细胞为本实验研究对象,以33.3mM葡萄糖刺激培养INS-1细胞构建糖毒性模型,以0.5mM棕榈酸刺激培养INS-1细胞构建脂毒性模型,33.3mM葡萄糖联合0.5 mM棕榈酸刺激培养INS-1细胞构建糖脂毒性模型。制备糖耐康含药血清,分糖耐康低（5%）、中（8%）、高（10%）剂量进行干预,以盐酸二甲双胍作为西药对照,以高糖、棕榈酸、高糖联合棕榈酸分别作为模型对照。CCK-8检测各组INS-1细胞活力、流式细胞荧光染色以及caspase-3活性观察细胞凋亡、ELISA测葡萄糖刺激下INS-1细胞的胰岛素分泌功能。

2.糖耐康含药血清对糖脂毒损伤的INS-1细胞胰岛素信号转导通路的影响糖脂毒造模方法同上。制备糖耐康含药血清,分糖耐康低（5%）、中（8%）、高（10%）剂量进行干预,以盐酸二甲双胍作为西药对照,以高糖、棕榈酸、高糖联合棕榈酸分别作为模型对照。采用免疫印迹法测定胰岛素信号转导通路中胰岛素受体底物-2（IRS2）及PI3K下游相关蛋白:叉头转录因子（FOXO1）,蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）的蛋白质含量,以及IRS2（ser731）、FOX01（ser256）、P70s6k（htr389）的磷酸化水平。

参考文献

[1]Crucial Role of Postsynaptic Syntaxin 4 in Mediating Basal Neurotransmission and Synaptic Plasticity in Hippocampal CA1 Neurons[J].Na-Ryum Bin,Ke Ma,Hidekiyo Harada,Chi-Wei Tien,Fiona Bergin,Kyoko Sugita,Thomas T.Luyben,Masahiro Narimatsu,Zhengping Jia,Jeffrey L.Wrana,Philippe P.Monnier,Liang Zhang,Kenichi Okamoto,Shuzo Sugita.Cell Reports.2018(10)

[2]Lysosome calcium in ROS regulation of autophagy[J].Xiaoli Zhang,Lu Yu,Haoxing Xu.Autophagy.2016(10)

[3]Metformin attenuates palmitic acid-induced insulin resistance in L6cells through the AMP-activated protein kinase/sterol regulatory element-bindingprotein-1c pathway[J].Wenjun Wu,Sunyinyan Tang,Junfeng Shi,Wenwen Yin,Shu Cao,Ruifang Bu,Dalong Zhu,Yan Bi.International Journal of Molecular Medicine.2015(6)

[4]Nymphayol increases glucose-stimulated insulin secretion by RIN-5F cells and GLUT4-mediated insulin sensitization in type 2 diabetic rat liver[J].P.Subash-Babu,S.Ignacimuthu,A.A.Alshatwi.Chemico-Biological Interactions.2014

[5]王磊.糖耐康对糖脂毒性诱导的胰岛细胞株INS-1损伤的保护作用研究[D].北京中医药大学,2019.