1,4-雄烯二酮的制备方法和应用举例

背景及概述^[1]

1,4-雄烯二酮(androsta-1,4-diene-3,17-dione，简称雄二烯二酮、 ADD) 和雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-dione，简称雄烯二酮、AD或4-AD)均是重要的甾类药物中间体，雄烯二酮(4-AD)既可作为雄性激素、促蛋白合成激素等激素类物质的前体，也可用于合成螺甾内酯、氢化可的松、氧化泼尼松，地塞米松等药物；而雄二烯二酮(ADD)可用于雌性激素、口服避孕药等药物的合成。

3-甾酮-1,2-脱氢酶(KsdD) 催化雄烯二酮(4-AD)的C1,2位脱氢反应生成1,4-雄烯二酮(ADD)。当甾体类化合物导入双键后，如在抗炎甾体激素药物母核的C1,2位导入双键后，能成倍地增加其抗炎作用，如醋酸可的松C1,2位上导入双键后行成的醋酸脱氢可的松，其抗炎作用提高了3-4倍，并且减少了由钠滞留而带来的副作用；还有许多临床上常用的重要甾体化合物的生产，特别是大多数具有抗炎能力的肾上腺皮质激素的生产均涉及到微生物C1,2位的脱氢反应，包括氢化泼尼松(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、帕拉米松(paramethasone)、倍他米松(batemethasone)、氟可龙(fluocortolone)、氟轻松(fluocinolone)、曲安西龙(triamcinolone)、甲基强的松龙(medrol)等。

制备^[1]

1.植物甾醇转化为4-AD

1.1种子培养

菌种名称：mycobacterium sp.B-NRRL 3683

1.1.1斜面培养基

配方：蛋白胨0.1-1.0g/L，酵母膏0.1-1.0g/L，葡萄糖0.1-1.0g/L，磷酸氢二钠0.1-1.0g/L，琼脂20g/L，pH＝7.5-8.0。

121℃灭菌30分钟。凝固成型后，在无菌条件下接种。

接种后，30℃培养4天，入4℃冰箱保存，保存时间不超过1个月。

1.1.2摇瓶种子培养基

配方：蛋白胨0.1-1.0g/L，酵母膏0.1-1.0g/L，葡萄糖0.1-1.0g/L，磷酸氢二钠0.1-1.0g/L，pH＝7.5-8.0。121℃灭菌30分钟。冷却至室温。

1.1.2.1一级培养

在无菌条件下接种，接种量：每100毫升刮取1环。接种后，30℃，200rpm 摇床培养48小时。

1.1.2.2二级培养

在无菌条件下接种，接种量：10％。接种后，30℃，200rpm摇床培养48小时。

1.2 10升罐发酵转化

转化在10升罐中进行。计料体积：6升。接种后体积：6升。

1.2.1转化培养基

配方：玉米浆1-10％，硝酸钠0.1-1％，磷酸氢二铵0.01-0.1％，PPE0.1-2％，植物甾醇3％，大豆油16％，pH＝7.5-8.0。121℃灭菌30分钟，冷却至室温，于无菌条件下接种，接种量：20％。

1.2.2转化条件

28-32℃，200rpm，空气流量0.1-1.0vvm，罐压0.01-0.1MPa，转化时间88 小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。

1.3脱氢前物料处理

将发酵完毕的发酵液加热至80℃，保温静置2小时，分层，下层水相作废水处理，得到上层油层。

2.4-AD转化为ADD

2.1种子培养

菌种名称：简单诺卡氏菌

2.1.1斜面培养

培养基配方：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.15％，酵母浸膏0.01-0.05％和琼脂粉2％，PH＝7.0-7.2。培养条件：30±1℃，3-5天。

2.1.2一级种子培养

培养基配方：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.15％和酵母浸膏0.01-0.05％，PH＝7.0-7.2。培养条件：500毫升摇瓶装100毫升培养基，摇床培养，转速200rpm，30 ±1℃，培养时间24小时。

2.1.3二级种子培养

培养基配方：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.25％，4-AD 0.05％和泡敌0.02％，PH＝7.0-7.2。培养条件：500毫升摇瓶装100毫升培养基，摇床培养，转速200rpm，30±1℃，培养时间16-24小时。

2.1.4 10升罐种子转化培养

培养基配方：葡萄糖0.1-1％，玉米浆0.1-1％，蛋白胨0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.25％，4-AD 0.05％和泡敌0.02％，PH＝7.0-7.2。121℃灭菌30分钟，冷却到30℃接种，接种量10％。加入步骤1.3中得到的油层，培养条件：28-32℃，200rpm，空气流量 0.1-1.0vvm，罐压0.01-0.1MPa，转化时间64小时，TLC点板监控转化情况，待转化完毕。

3.提取及精制

3.1提取

(1)将转化完毕的发酵液加热到80℃，静置2小时，分去水层，留油层；

(2)油层加入3升甲醇，常温搅拌20分钟，静置2小时，分出上层甲醇， 50℃减压浓缩干，加入少量水，带干其中残留的甲醇，冷却到30℃以下，抽滤出料；

(3)步骤(2)分离得到的油层再用甲醇提取两次，每次使用3升甲醇，将步骤(2)和步骤(3)分离出的甲醇合并，升温减压浓缩；

(4)浓缩得到的混合物过滤，得到的固体即ADD粗品。

3.2精制

(1)得到的ADD粗品，加入2％浓度的氢氧化钠溶液500毫升，升温至60℃，皂化2小时；

(2)冷却至10-20℃，抽滤并淋洗至中性，得类白色固体；

(3)得到的固体50℃烘干，称重，加入4V甲醇，升温至60℃，搅拌溶清，加入0.1W活性炭，搅拌脱色2小时，趁热抽滤并淋洗，滤液减压浓缩至2V体积，冷却至4℃，养晶1小时，抽滤；

(4)滤饼烘干，收ADD 55.2克，纯度99.5％。

应用^[2]

CN201310615259.2报道了一种以1，4-雄烯二酮为原料制备黄体酮的方法，包括以下步骤：1)将1，4-雄烯二酮溶于有机溶剂中，并加入原甲酸三甲酯或原甲酸三乙酯的酸，通入氮气对的1，4-雄烯二酮进行保护，合成1，4-雄烯二酮的烯醇醚，即3-甲氧基-雄甾3,5-二烯-20-酮；2)将(1-甲氧基乙基)-三苯基膦盐分散于反应介质有机溶剂中，低温下，加入碱，然后，与步骤1)合成的3-甲氧基-雄甾3,5-二烯-20-酮进行维蒂希反应，纯化结晶，得到黄体酮。该方法采用1，4-雄烯二酮为原料，解决了黄体酮等甾体药物合成原料资源匮乏的问题，并提高了1，4-雄烯二酮的利用率和黄体酮的收率，制备工艺简单。

参考文献

[1] [中国发明] CN201910982713.5 植物甾醇微生物转化制备ADD的方法

[2] CN201310615259.2一种以1，4-雄烯二酮为原料制备黄体酮的方法