原位细胞凋亡试剂盒的应用

背景^[1-3]

原位细胞凋亡试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3‘－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合；

在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

原位细胞凋亡检测图

原位细胞凋亡试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。

凋亡是许多正常的生理过程所必需的，包括免疫系统的成熟和作用机制、组织器官和肢体的发生、神经系统的发生等过程。在许多病理条件下，凋亡机制的调节失衡起很重要的作用，包括组织细胞的缺血、缺氧、出血、中风、心脏病、癌症、艾滋病、自身免疫缺损和中枢神经系统的退行性变等。在癌基因的研究方面，由于细胞凋亡可由抗癌药物、放射及高热等启动，并且肿瘤细胞具有由于一些癌基因表达即能启动凋亡的内在特性，因此细胞凋亡已引起人们的广泛重视。

操作步骤：

1、标记DNA链断端，由TdT催化，以FITC标记的核苷酸为原料，进行非模板依赖方式的3-OH端DNA末端聚合反应；

2、用HRP或AP标记的羊抗FITC的抗体（Fab段）与聚合到DNA末端的FITC结合；

3、用酶的底物显色，HRP常用DAB显色，AP常用BCIP/NBT显色。

应用^[4][5]

用于人植入前胚胎细胞超薄电镜切片的制作及应用TUNEL技术对该细胞凋亡的原位检测研究

改进人植入前胚胎细胞超薄切片的制备方法,观察不同时期人早期胚胎细胞超微结构的变化。方法:选取试管婴儿助孕技术后异常受精的3原核胚胎,于2-8细胞期进行固定,改进透射电镜的常规操作方法,使用3%～4%琼脂进行预包埋,制成超薄切片后在镜下观察植入前胚胎细胞凋亡的超微结构。

结果:在镜下可见胚胎细胞正常形态和凋亡的形态变化。

建立原位末端标记法（TdT-mediated nick end labeling TUNEL）检测人植入前胚胎凋亡征象的方法。

方法:取试管婴儿助孕技术后异常受精的3原核胚胎,于2-10细胞期进行固定,采用TUNEL法检测3原核胚胎中的凋亡征象。

结果:TUNEL阳性信号为绿色强荧光,位于胞核,呈环状或颗粒状。在发育正常和发育停滞胚胎中,未检测到凋亡征象;在有碎片的胚胎中20%可检测到TUNEL阳性信号。

结论:采用TUNEL法加荧光共焦显微镜观察凋亡细胞的方法可以有效检测人植入前胚胎中的凋亡征象,其中细胞碎片的出现可能与凋亡有关。

参考文献

[1]Expression of Bcl-2 and Bax proteins in relation to quality of bovine oocytes and embryos produced in vitro[J].Ming Yuan Yang,Rajadurai Rajamahendran.Animal Reproduction Science.2002(3)

[2]Villous cytotrophoblast regulation of the syncytial apoptotic cascade in the human placenta[J].B.Huppertz,Hans-Georg Frank,John C.P.Kingdom,Frank Reister,Peter Kaufmann.Histochemistry and Cell Biology.1998(5)

[3]Morphological and biochemical characterization and analysis of apoptosis[J].R.Todd Allen,William J.Hunter,Devendra K.Agrawal.Journal of Pharmacological and Toxicological Methods.1997(4)

[4]Antigen Retrieval Immunohistochemistry:Practice and Development[J].Shi,Cote,Young,Taylor.Journal of Histotechnology.1997(2)

[5]王丹.人植入前胚胎细胞超薄电镜切片的制作及应用TUNEL技术对该细胞凋亡的原位检测[D].华中科技大学,2006.