MACH1-T1 感受态细胞的应用

背景^[1-3]

MACH1-T1感受态细胞是采用大肠杆菌Mach1-T1菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。使用pUC19质粒检测，转化效率可达10⁹ cfu/µg。

感受态细胞构建流程

产品特点：

1.Mach1-T1感受态细胞是目前生长速度最快的感受态细胞，在氨苄青霉素平板上，8-9小时可见克隆；

2.用于蓝、白斑筛选，12小时可见蓝斑；

3.将过夜培养的单克隆在2ml的LB培养基中培养4-5小时即可进行小量质粒提取；

4.适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，减少克隆DNA同源重组的发生，提高质粒DNA的产量和质量；

5. 具有T1，T5噬菌体抗性。使用pUC19质粒检测，转化效率可达109cfu/μg。

Mach1-T1菌株由野生型non-K-12 E.Coli W菌株改造而来，是目前生长速度较快的感受态细胞之一，在平板上8h可见克隆，缺失核酸内切酶(endA)，提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型(recA1398)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA的稳定性；lacZΔM15的存在使Mach1-T1可用于蓝、白斑筛选；tonA突变赋予Mach1-T1菌株对噬菌体T1和T5的抗性。Mach1-T1感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>109cfu/μg DNA。

操作方法

1.Mach1-T1感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。

4.5000 rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作，将平板放37℃培养至少13小时。

应用^[4][5]

用于从噬菌体十二肽库中筛选人钠泵α1亚基M1-M2膜外区特异性结合肽的研究

钠泵α1亚基M1-M2膜外区蛋白的克隆和表达目的:利用基因重组技术构建钠泵α1亚基M1-M2膜外区蛋白的表达载体,通过诱导表达获得蛋白,为随机肽库筛选实验提供靶分子。

方法:（1）钠泵α1亚基M1-M2克隆载体的构建。以质粒YhNα1（含人钠泵α1亚基cDNA序列）为模板,PCR扩增得到α1亚基的2个基因片段:T1T2,T1T2D,其中T1T2含α1亚基N端至M2碱基序列,T1T2D含α1亚基N端至M1碱基序列。分别将其加尾后连接至克隆载体pGM-T并转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,得到质粒pGMT-T1T2,pGMT-T1T2D。测序验证基因序列是否与理论结果一致。

（2）钠泵α1亚基M1-M2蛋白表达体系的构建。分别从T载体质粒上切下目的基因片段,双酶切连接到表达载体pET32a（+）上并转化入大肠杆菌Rosetta2,挑选阳性克隆,得到质粒pET32a（+）-T1T2,pET32a（+）-T1T2D。双酶切验证目的基因序列是否正确。1%接种表达菌,用终浓度为0.4 mM的IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达。

结果:（1）以质粒YhNα1为模板进行PCR扩增得到基因片段T1T2,T1T2D,产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测,在相应的位置出现明显的条带,说明基因片段扩增成功。将其加尾后连接至pGM-T载体并转化入大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆扩增并提取质粒,双酶切和测序结果显示基因序列与理论一致。

（2）分别将目的基因片段与同样双酶切的pET32a（+）表达载体相连,转化Rosetta2感受态细胞,在含Amp的平板上筛选重组子。双酶切结果表明蛋白表达体系构建成功。

参考文献

[1]Phage display systems and their applications[J].Matthias Paschke.Applied Microbiology and Biotechnology.2006(1)

[2]Na+,K+-ATPase Isozyme Diversity;Comparative Biochemistry and Physiological Implications of Novel Functional Interactions[J].Ali Mobasheri,Julio Avila,Irene Cózar-Castellano,Michael D.Brownleader,Michael Trevan,Martin J.O.Francis,Joseph F.Lamb,Pablo Martín-Vasallo.Bioscience Reports.2000(2)

[3]Brain Renin-Angiotensin System and Ouabain-Induced Sympathetic Hyperactivity and Hypertension in Wistar Rats[J].Bing S.Huang,Frans H.H.Leenen.Hypertension.1999(1)

[4]A fully human antibody neutralising biologically active human TGFβ2 for use in therapy[J].Julia E Thompson,Tristan J Vaughan,Andrew J Williams,Jane Wilton,Kevin S Johnson,Louise Bacon,Jonathan A Green,Ray Field,Steven Ruddock,Mia Martins,Anthony R Pope,Philip R Tempest,Ronald H Jackson.Journal of Immunological Methods.1999(1)

[5]刘志文.从噬菌体十二肽库中筛选人钠泵α1亚基M1-M2膜外区特异性结合肽的研究[D].河北医科大学,2010.