血清血浆MICRORNA提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

血清血浆MICRORNA提取试剂盒是目前提取小RNA（<200nt）操作步骤最简单、重复性、小RNA产率最高的方法之一。使用该试剂盒通过一步上柱即可获得高纯度miRNA，可在10min左右完成小RNA的提取；且使用该试剂盒提取的小RNA（Small RNA）中，长度在15～200nt范围的RNA在95%以上，基本不含有大RNA和DNA，可直接用于后续的反转录、Northern杂交、测序等应用。

血清血浆MICRORNA2100质检峰图

使用方法：

自备试剂：异丙醇、乙醇、75%异丙醇

1.向1.5mL EP管中加入600µL Serum/Plasma miRNAReagent。将500µL血清或血浆样本加入到上述600µL miRNA Reagent A中，漩涡30 s混合均匀。

2.13000 rpm离心5 min，将上清约1 mL倒入到新的2 mL EP管中。加入1 mL异丙醇，上下颠倒混合均匀。

3.将上述溶液分三次倒入到吸附柱中（每次约700µL），13000 rpm离心15s，倒掉过柱液。

4.向吸附柱中加入700µL 75%异丙醇洗涤一次，13000 rpm离心15s，倒掉过滤液。

5.向吸附柱中加入500µL无水乙醇洗涤一次，13000 rpm离心15s，倒掉过滤液。

6.吸附柱13000 rpm空离心2min，去掉残留的乙醇。

7.将吸附柱放入到新1.5 mL EP管中，室温放置2 min，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30µL Rnase Free TEBuffer，室温静置2 min，13000 rpm离2 min，洗脱产物即为提取的miRNA。

应用^[4][5]

用于非小细胞肺癌诊断新标志物：外泌体microRNA-744-5p研究

外泌体（exosomes）是细胞释放的,直径在40-150nm的细胞外囊泡,其内包裹的核酸和蛋白质能够反应细胞的内在变化,并且在疾病的发生进展中起着重要作用。

尝试鉴别在非小细胞肺癌尤其是早期非小细胞肺癌与健康人群差异表达的exosomal微小RNA（microRNA）,筛选出可作为诊断早期非小细胞肺癌的生物标志物。方法首先分析课题组前期血清及细胞上清exosomes测序结果,筛选出在肺癌exosomes中显著差异表达的microRNA。

进一步使用Exoquick外泌体分离试剂盒提取血清中的exosomes,通过实时荧光定量PCR分析非小细胞肺癌与健康对照组血清exosomes中microRNA的表达差异,通过计算受试者工作特征曲线（ROC曲线）评价候选生物标志物的诊断效能。通过实时荧光定量PCR观察潜在microRNA在肺癌组织以及肺癌细胞中的表达水平。采用细胞增殖试剂盒检测microRNA对肿瘤细胞增殖能力的影响。

通过细胞侵袭实验和细胞迁移实验验证目的基因对肿瘤细胞迁移侵袭能力的改变。结果1 microRNA-192-5p、microRNA-320a、microRNA-484、microRNA-2110和microRNA-744-5p在非小细胞肺癌患者血清exosomes中低表达,差异具有统计学意义。2 Exosomal microRNA-744-5p对早期非小细胞肺癌具有较好的诊断效能,其ROC曲线下面积达到0.943。

参考文献

[1]Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].Freddie Bray BSc,MSc,PhD,Jacques Ferlay ME,Isabelle Soerjomataram MD,MSc,PhD,Rebecca L.Siegel MPH,Lindsey A.Torre MSPH,Ahmedin Jemal PhD,DVM.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2018(6)

[2]microRNA-1246 Is an Exosomal Biomarker for Aggressive Prostate Cancer[J].Divya Bhagirath,Thao Ly Yang,Nathan Bucay,Kirandeep Sekhon,Shahana Majid,Varahram Shahryari,Rajvir Dahiya,Yuichiro Tanaka,Sharanjot Saini.Cancer Research.2018(7)

[3]Detection of circulating miRNAs:comparative analysis of extracellular vesicle-incorporated miRNAs and cell-free miRNAs in whole plasma of prostate cancer patients[J].Edgars Endzeli??,Andreas Berger,Vita Melne,Cristina Bajo-Santos,Kristīne Sobo?evska,Artūrsābols,Marta Rodriguez,Daiga?antare,Anastasija Rud?ickiha,Vilnis Lietuvietis,Alicia Llorente,Aija Linē.BMC Cancer.2017(1)

[4]Evaluation of Tumor-Derived Exosomal miRNA as Potential Diagnostic Biomarkers for Early-Stage Non–Small Cell Lung Cancer Using Next-Generation Sequencing[J].Xiance Jin,Yanfan Chen,Hanbin Chen,Shaoran Fei,Didi Chen,Xiaona Cai,Linger Liu,Baochai Lin,Huafang Su,Lihao Zhao,Meng Su,Huanle Pan,Lanxiao Shen,Deyao Xie,Congying Xie.Clinical Cancer Research.2017(17)

[5]李少鹏.非小细胞肺癌诊断新标志物：外泌体microRNA-744-5p[D].南方医科大学,2020.