人硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中人硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP）水平。

用纯化的人硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP），再与HRP标记的硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

人硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)结构图

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP）含量。

操作步骤：

1、用缓冲液将抗体稀释至1-10ug/ml。在反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次。

2、加样：加一定稀释的待检样品0.05ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.05ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4、加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5、终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml

6、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

应用^[4][5]

用于硫氧还蛋白互作蛋白TXNIP抑癌机制研究

肿瘤细胞中,硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP,Thioredoxin-interacting protein）的表达量显著降低,而且很多研究表明,TXNIP是一个潜在的抑癌因子,但是TXNIP的抑癌机制却仍有待探究。

利用GFP标记的TXNIP发现,TXNIP也定位在细胞核,进一步的研究表明TXNIP可以定位于细胞核中的Cajal Bodies和核仁区。因此,根据TXNIP在细胞核当中的定位,从TXNIP对组蛋白表达的影响和对rRNA表达的影响这两方面来探究TXNIP的抑癌机制。

结果发现,与正常组织相比,TXNIP在结直肠病变组织当中表达量显著降低;克隆形成结果表明,过表达TXNIP能够抑制细胞的增殖;过表达TXNIP后癌细胞的细胞周期被阻滞在G1期,使细胞无法进入S期表达组蛋白;

TXNIP与控制组蛋白合成的NPAT（Nuclear Protein Ataxia-Telangiectasia）之间存在相互作用,TXNIP又可能通过抑制NPAT的表达来抑制组蛋白的表达;

除此之外,CHIP实验发现,TXNIP能够与各类组蛋白启动子结合,双萤光素酶报告基因实验进一步证明TXNIP与组蛋白启动子的结合能够抑制组蛋白启动子的活性。

同样的,CHIP实验结果也表明,TXNIP能够与rDNA的启动子结合。这些结果启示,TXNIP在抑制组蛋白基因表达和rRNA基因表达方面起重要作用,进而影响细胞的生长。

参考文献

[1]Vitamin D3 Up-Regulated Protein 1 Mediates Oxidative Stress Via Suppressing the Thioredoxin Function.Eunsung Junn,Seung Hyun Han,Joo Young Im,Young Yang,Eun Wie Cho,Hong Duck Um,Do Kyun Kim,Kang Woo Lee,Pyung Lim Han,Sue Goo Rhee,Inpyo Ch.J.Immunol.2000

[2]Knockdown of RNF2 induces cell cycle arrest and apoptosis in prostate cancer cells through the upregulation of TXNIP.Wei M,Jiao D,Han D,et al.Oncotarget.2017

[3]The Role of Txnip in Mitophagy Dysregulation and Inflammasome Activation in Diabetic Retinopathy:ANew Perspective.Lalit P Singh,Takhellambam S Devi,Thangal Yumnamcha.JOJ Ophthalmol.2017

[4]Features of 80S mammalian ribosome and its subunits.Budkevich Tatyana V,El’skaya Anna V,Nierhaus Knud H.Nucleic Acids Research.2008

[5]扶涛.硫氧还蛋白互作蛋白TXNIP抑癌机制初探[D].浙江大学,2019.