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人血栓调节蛋白(TM)ELISA 试剂盒的应用

发布日期:2021/3/1 10:56:00

背景[1-3]

人血栓调节蛋白(TM)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定样品指标水平。样品包括血清血浆尿液脑脊液细胞固体组织等,用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入样品,再与HRP标记的抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中浓度,或者与CUTOFF值相比较,从而判定标本阴阳性。

人血栓调节蛋白(TM)ELISA 产品图

人血栓调节蛋白(TM)Elisa试剂盒操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

3.样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。

4.除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)

6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用[4][5]

用于人血栓调节蛋白转基因克隆猪的制备及表达鉴定研究

以大白猪TM基因座BAC为模板,通过PCR技术构建抓捕载体PBR322-catch,经序列测定,同源性为100%。再利用Red同源重组系统介导的“gap–repair”基因抓捕技术,从含大白猪TM基因座的BAC(细菌人工染色体)上亚克隆7kb的TM启动子,经酶切鉴定,大小与预期一致。

通过PCR技术获得表达载体所需各元件的亚克隆片段,经T-A克隆,酶切、回收、酶连至克隆载体pBlueScriptⅡ(SK-)中,再将获得的完全同源的TM启动子连入表达载体中,构建完成含有嘌呤抗性(Puromycin,Puro)的血管内皮细胞特异性的表达载体pBS-hTM。

将构建完成的抓捕载体经Xhol I线性化后,通过电击转染胎儿成纤维细胞系WPF176和WPF169,用含有1.0μg/mL嘌呤霉素筛选培养液进行约1015天的筛选,共获得克隆点354个,经过PCR鉴定含有15个阴性细胞克隆点。

以其中2个生长状态较好的hTM阳性细胞克隆做为供体细胞进行核移植,重构胚经融合激活后进行体外培养,其体外发育能力与普通重构胚无显著差异(P>0.05)。先后将972个重构胚移植到5头受体母猪体内,30天后B超检测怀孕2头,妊娠120天后共生产仔猪5头,其中1头死亡,其余4头生长状况良好,无畸形及其他异常状况。

经新生仔猪耳组织基因组PCR鉴定,组织RT-PCR以及Western blot鉴定,5头仔猪中1头为阴性,其余4头均为阳性,且严格遵循血管内皮细胞的特异性表达。

综上所述,成功获得血管内皮特异性表达hTM基因的转基因克隆五指山小型猪,异种移植后的凝血紊乱问题有望解决,且显著延长术后的存活时间。为多基因修饰猪的制备奠定的实践基础,进一步推动异种移植在临床研究方面的发展。

参考文献

[1]Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation[J].NikolaiKlymiuk,BernhardAigner,GottfriedBrem,EckhardWolf.Mol.Reprod.Dev..2010(3)

[2]Artificial chromosome formation in maize(Zea mays L.)[J].Evgueni V.Ananiev,Chengcang Wu,Mark A.Chamberlin,Sergei Svitashev,Chris Schwartz,William Gordon-Kamm,Scott Tingey.Chromosoma.2009(2)

[3]Expression of Tissue Factor and Initiation of Clotting by Human Platelets and Monocytes After Incubation With Porcine Endothelial Cells[J].Chih Che Lin,Daxin Chen,John H.McVey,David K.C.Cooper,Anthony Dorling.Transplantation.2008(5)

[4]WZS‐pig is a potential donor alternative in corneal xenotransplantation[J].PanZhiqiang,SunCun,JieYing,WangNingli,WangLi.Xenotransplantation.2007(6)

[5]王梦佳.人血栓调节蛋白转基因克隆猪的制备及表达鉴定[D].河南大学,2014.

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