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一种制备培西加南的方法

发布日期:2021/2/8 9:49:23

背景技术

培西加南,英名为:pexiganan,是含有22个氨基酸的线性多肽,培西加南是葛兰素史克公司和Genaera公司(原MagaininPharmaceuticals公司)联合开发的产品。它作为一种广谱的局用抗菌剂,用于治疗糖尿病足部溃疡的感染。培西加南最初是从爪蟾的腹部皮肤分离来的,为动物源的多肽类抗菌药物,是多肽类抗生素族magainin的一员,也是近20年来第2种新的抗生素族,能有效地对抗3000多种分离菌株,包括细菌(革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和厌氧菌)、变形虫、真菌和寄生虫。培西加南作用机制不同于其它的抗生素,主要通过攻击微生物的细胞膜来杀菌,而大多数其它的抗生素则是使细菌关键蛋白失去功能。因此,有望成为新一代的抗菌剂。

由于爪蟾的正常细胞组织中含量有限,直接获得培西加南非常困难。CN200510014833和W02011069280均报道了培西加南的基因工程的生产方法,采用基因工程技术制备抗菌肽,由于存在在于发酵表达量少,收率低,生产成本高的缺点,因此不利于工业化大生产。目前,多肽的合成主要还是运用固相多肽合成法制备,W02011069280还报道了培西加南的类似物的多肽固相逐步偶联合成方法,此方法合成步骤较多,合成周期长,纯度和收率不高,特别在偶联两个赖氨酸时难以避免产生缺失肽杂质,因此也不适合规模化生产。

综上所述,现有培西加南的制备过程中,合成步骤较多,合成周期长,效率低,纯度和收率不高,特别在偶联两个赖氨酸时难以避免产生缺失肽杂质,不适合规模化生产。

发明内容

本发明人用现有的合成方法,制备培西加南,发现现有技术存在的技术问题是:合成步骤较多,合成周期长,效率低,纯度和收率不高,特别在偶联两个赖氨酸时难以避免产生缺失肽杂质,不适合规模化生产。为此,本发明人对培西加南的合成方法进行了研究,从而得到了本发明的技术方案。

本发明的目的是提供一种制备培西加南的方法。本发明的合成路线如图1所示:首先通过液相法合成二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH;其次采用固相合成法,以氨基树脂为起始树脂,按照培西加南主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸,其中7、8位,10、11位和21、22位氨基酸偶联采用二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH偶联;肽树脂裂解,纯化,冻干后得到培西加南。

为此本发明提供一种培西加南的合成方法,其步骤如下:

步骤1,通过液相法合成二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH;

步骤2,采用固相合成法,以氨基树脂为起始树脂,按照培西加南主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸,其中7、8位,10、11位和21、22位氨基酸偶联采用二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH偶联;

步骤3,肽树脂裂解,纯化,冻干后得到培西加南。

其中,步骤1所述的二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH的合成方法包括如下步骤:1)Fmoc-Lys(Boc)-OH、HOSu和DCC偶联得到Fmoc-Lys(Boc)-OSu,然后Fmoc-Lys(Boc)-OSu和H-Lys(Boc)-OH反应得到二肤片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH。

其中,步骤2所述的固相合成方法,所述方法包括以下步骤:

1)采用0.1~0.60mmol/g的氨基树脂为起始树脂;

2)采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除氨基树脂上的Fmoc保护基;

3)在偶联剂系统的存在下,氨基树脂和偶联得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-氨基树脂;

4)重复步骤2)、3),按照培西加南主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸,其中7、8位,10、11位氨基酸偶联采用二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH偶联,偶联氛基酸顺序为:Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gly-〇H。

所述氛基树脂选自RinkAmideAM树脂、RinkAmideMBHA树脂,优选RinkAmideMBHA树脂;其中所述氨基树脂的替代度为〇.l(T0.60mmol/g,优选为0.15~0.40mmol/g;所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂,所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA;所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的组合。

本发明中,所述的树脂的取代度是采用紫外吸光光度法测定的树脂的取代度,用20%哌啶/DMF溶液将偶联Fmoc保护型氨基酸的树脂上的Fmoc保护基脱保护下来,用紫外吸光光度法测定其浓度,然后采用含Fmoc的氨基酸标准化合物例如Fmoc-Leu-OH,以外标法标定树脂上的Fmoc的mmol数值,除以树脂重量,即得到树脂的取代度或称之为替代度。

本发明的有益效果是:选用二肽片段FmoC-Lys(BoC)-LyS(BoC)-OH高效率、相对低成本的固相合成了培西加南,解决了两个赖氨酸偶联不完全,合成收率低,杂质多,不适用于工业化生产的问题;本发明提供了一种合成周期短、效率高、成本低、收率较高,适合规模化生产的培西加南的合成工艺。

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以下通过实施例进一步说明本发明。

具体地,关于下面实施例中涉及的各商购氨基酸以及氨基酸片段,以及各商购树月旨,其生产厂家和商品型号如下:Fmoc保护基氨基酸原料、和树脂均为常规的市售试剂(厂家:吉尔生化(上海)有限公司;化学纯);二肽片段Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH是本专利描述合成的。

有机溶剂和其它原料来源均为市售品(厂家:国药集团化学试剂有限公司;化学纯)。

另外,下面实施例中提到的"旋蒸浓缩"以及"冻干"以及测定HPLC和质谱的条件和所用设备型号及生产厂家说明如下:旋蒸浓缩设备:旋转蒸发仪R-200/205(瑞士Buchi(布奇)公司);旋蒸浓缩条件:30°C下,真空(-0.1Mpa)条件下旋蒸浓缩,浓缩后体积在旋蒸前总体积75%以下。

冻干设备:冻干机FD-3(北京博医康实验仪器有限公司);冻干条件:将冻干盘放入冰箱冷冻室(-20°C)中,预冻6小时。开启冻干机,打开制冷,预冷30分钟以上,设置冻干曲线如下:段:在-27°C运行16小时;第二段:在-5°C运行4小时;第三段:在5°C运行2小时;第四段:在30°C运行16小时。

HPLC=Dionex高效液相色谱仪;用十八烷基硅烷键合硅胶(5iim,250X4.6mm)为填充剂;以0.1%TFA溶液为流动相A,以乙腈为流动相B,进行梯度洗脱;流速为每分钟1.0ml;检测波长为220nm;柱温30°C。取供试品溶液20ml,注入液相色谱仪,记录色谱图。质谱:MALDI-TOF-MS基质辅助激光解析电离飞行时间质谱;仪器型号为AUTOFLEXSPEEDTOF-TOF。

Fmoc-Lys(Boc)-OSu活化酯的合成称取468.50gFmoc-Lys(Boc)-OH(1.0mol),138.10gHOSu(1.2mol)加入2000mlDMF中,冰水浴下加入247.59gDCC(1.2mol),反应1小时,升温到室温反应3小时,反应液过滤,母液旋干,加DCM溶解,过滤,冰乙醇重结晶3次,过滤,固体油泵拉干得到503.37gFmoc-Lys(Boc)-OSu活化酯,收率89%。

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