人端粒酶逆转录酶(TERT) ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人端粒酶逆转录酶(TERT)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中人端粒酶逆转录酶（TERT）的含量。

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人端粒酶逆转录酶（TERT）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人端粒酶逆转录酶（TERT）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于人端粒酶逆转录酶下调p53抑制胃癌细胞铁死亡的机制研究

研究人端粒酶逆转录酶h TERT在胃癌细胞中调控铁死亡的作用及分子机制。

方法:1.以人胃癌细胞株为研究对象,erastin作为铁死亡诱导剂,在五株胃癌细胞SNU-1、SGC7901、MGC803、AGS、MKN45细胞中建立肿瘤细胞铁死亡模型。用erastin以一定的浓度梯度:1u M,2.5u M,5u,10u M,15u M,20u M,40u M处理胃癌细胞24小时,用CCK-8检测生长抑制率,通过q-PCR检测五株胃癌细胞内h TERT、SLC7A11、GPX4的表达确定后续实验研究对象为SNU-1和SGC791这两株胃癌细胞。

2. 为研究erastin杀死肿瘤细胞是否是通过诱导铁死亡,用erastin 20u M处理SNU-1,SGC7901两株胃癌细胞,通过透射电镜成像观察细胞内线粒体的变化以及其它亚细胞器的变化。分别用铁死亡抑制剂Fer-1,凋亡抑制剂Z-VAD-fmk,坏死抑制剂necrosttin-1,自噬抑制剂3-MA和erastin共处理细胞24小时,通过CCK-8检测生长抑制率,GSH检测试剂盒检测细胞内谷胱甘肽含量,MDA试剂盒检测细胞内脂质过氧化情况。

3.研究h TERT铁死亡时,首先通过GEO数据库分析在胃癌中,h TERT和GPX4的表达相关,并用erastin刺激两株胃癌细胞后提取蛋白进行h TRET蛋白检测。通过构建h TERT稳定过表达细胞株lenti-h TERT-SNU-1/lenti-NC-SNU-1;lenti-h TERT-SGC7901/lenti-NC-SGC7901。用erastin（20u M）处理细胞24小时后,CCK-8检测生长抑制率,Western blot检测细胞内h TERT、p53、SLC7A11、GPX4的表达,q-PCR检测p53的表达。用蛋白酶体抑制剂MG123和erastin共处理细胞,检测细胞内p53蛋白水平。

参考文献

[1]Ferroptosis:Death by Lipid Peroxidation[J].Wan Seok Yang,Brent R.Stockwell.Trends in Cell Biology.2016(3)

[2]Activation of the p62‐Keap1‐NRF2 pathway protects against ferroptosis in hepatocellular carcinoma cells[J].Xiaofang Sun,Zhanhui Ou,Ruochan Chen,Xiaohua Niu,De Chen,Rui Kang,Daolin Tang.Hepatology.2016(1)

[3]The retinoblastoma（Rb）protein regulates ferroptosis induced by sorafenib in human hepatocellular carcinoma cells[J].Christophe Louandre,Ingrid Marcq,Hicham Bouhlal,Emma Lachaier,Corinne Godin,Zuzana Saidak,Catherine Fran?ois,Denis Chatelain,Véronique Debuysscher,Jean-Claude Barbare,Bruno Chauffert,Antoine Galmiche.Cancer Letters.2015(2)

[4]miR-1182 attenuates gastric cancer proliferation and metastasis by targeting the open reading frame of hTERT[J].Dan Zhang,Yu-Feng Xiao,Jian-Wei Zhang,Rui Xie,Chang-Jiang Hu,Bo Tang,Su-Min Wang,Yu-Yun Wu,Ning-Bo Hao,Shi-Ming Yang.Cancer Letters.2015(2)

[5]周希.人端粒酶逆转录酶下调p53抑制胃癌细胞铁死亡的机制研究[D].西南医科大学,2018.