植物水杨酸(SA)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

植物水杨酸(SA)ELISA试剂盒是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

植物水杨酸(SA)Elisa试剂盒操作程序

1、所有试剂和组分都先恢复到室温（平衡1小时），标准品、质控品和样品，建议做复孔。

2、按前面试剂准备中描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。

3、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。

4、设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本孔加待测样本50μL，空白孔不加。

5、除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL。

6、用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

7、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干。

8、如此重复4次（共洗板5次）。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡20s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。

9、将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育15min。

10、所有孔加入终止液50μL，在酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。

应用^[4][5]

用于内源水杨酸对拟南芥应答二氧化氮胁迫的调节作用研究

研究内源水杨酸在植物对二氧化氮应答中的调节作用,选用与水杨酸含量或信号转导相关的5种不同基因型拟南芥:野生型（Columbia）、内源水杨酸高积累突变体（snc1）、内源水杨酸缺失的转基因植株（NahG）、内源水杨酸合成受阻突变体（sid2）和水杨酸信号转导阻断突变体（npr1-1）为试材。先对六周龄野生型拟南芥进行浓度梯度为0,3,6,9,18和36 ppm的NO2熏气实验,以确定合适的胁迫浓度,最终发现6 ppm为适宜浓度,诱发植物产生轻微可见的损伤。

对5种不同基因型拟南芥用6 ppm的NO2熏气处理7天,每天3小时,然后测定生理生化指标,主要结果如下:1.6 ppm的NO2胁迫对拟南芥造成生理上的伤害。内源水杨酸的增加在一定程度上缓解了这种伤害,如叶绿素a和叶绿素b含量下降幅度较少,丙二醛增长较缓,离子渗透率增加量较低,可溶性糖降幅较缓,可溶性蛋白含量增幅较高等;内源水杨酸的缺失及其信号转导受阻会使植株抗性相对减弱,植物光合系统、膜系统和渗透平衡等生理损伤相对较为严重。

2. NO2胁迫引起供试植株抗氧化系统发生变化,如抗氧化物酶SOD和POD活性上升,小分子抗氧化剂GSH和AsA含量增加。内源水杨酸的增加进一步增强了抗氧化物酶活性以及抗氧化剂含量;内源水杨酸的不足及其信号转导受阻会使植株抗氧化能力相对减弱。

3.在NO2胁迫下,植株大量吸收硝酸盐并诱导NR的合成,提高硝态氮的代谢水平,进而减少NO2胁迫造成的伤害。而内源水杨酸的作用能更好的维持细胞内环境稳定,保持氧化还原动态平衡,如丙二醛增长较缓,光合色素降幅较小等,进而增强NR活性,提高体内硝酸盐的同化速率,从而更有效地抵抗二氧化氮的胁迫伤害。

参考文献

[1]Characterization and Biological Function of the ISOCHORISMATE SYNTHASE2 Gene of Arabidopsis1[OA][J].Garcion,Christophe,Lohmann,Antje,Lamodière,Elisabeth,Catinot,Jérémy,Buchala,Antony,Doermann,Peter,Métraux,Jean-Pierre.Plant Physiology.2008(3)

[2]Plant disease resistance protein signaling:NBS–LRR proteins and their partners[J].Youssef Belkhadir,Rajagopal Subramaniam,Jeffery L Dangl.Current Opinion in Plant Biology.2004(4)

[3]Inducers of Plant Systemic Acquired Resistance Regulate NPR1 Function through Redox Changes[J].Zhonglin Mou,Weihua Fan,Xinnian Dong.Cell.2003(7)

[4]Physiology and Ecology of Plants under Stress.Post‐translational regulation of nitrate reductase:mechanism,physiological relevance and environmental triggers[J].Werner M.Kaiser.Journal of Experimental Botany.2001

[5]马群飞.内源水杨酸对拟南芥应答二氧化氮胁迫的调节作用[D].沈阳师范大学,2016.