细胞增殖实验的应用

背景^[1-3]

细胞增殖实验是判定细胞活力的重要指标，有多种显示方法，除实验的细胞计数法之外，还可以进行细胞分裂指数的测定。细胞分裂是细胞增殖的方式，能比较确切地反映细胞增殖度。

细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞；

同时，多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。真核细胞的分裂方式有三种，即有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。

其原理是用WST-8四唑盐（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium）能被活细胞内的脱氢酶还原成橙色甲臜染料，然后测定450 nm下的吸光值，生成的甲臜的量与活细胞数量成正比。

实验流程

1.收集对数期细胞，调整浓度。

2.将细胞种植于96孔板中，待细胞贴壁后加药。

3.5%CO2，37 oC孵育一定时间。

4.每孔中加入10μL CCK-8溶液，培养1-4 h。

5.取出96孔板，将其置于酶联免疫检测仪上，震荡15 s，然后在450 nm下测量吸光。

6.结果统计分析。

应用^[4][5]

用于microRNA-451a/YWHAZ调控肺腺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的实验研究

探讨microRNA-451a/YWHAZ对肺腺癌A549细胞生物学行为的影响。

方法:（1）过表达microRNA-451a的慢病毒及其阴性对照感染A549细胞,稳定传代后用嘌呤霉素进行药筛以获取慢病毒感染后的稳定细胞株;qRT-PCR检测慢病毒感染率;随后两组细胞进行CCK8实验、细胞集落形成实验、细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞生物学行为的变化。

（2）使用生物信息学方法,即Targetscan和miRDB预测microRNA-451a的潜在靶点YWHAZ。

（3）沉默YWHAZ的慢病毒及其阴性对照组感染A549细胞,筛选稳转细胞株进行CCK8实验、集落形成实验、细胞划痕实验、Transwell实验,以检测两组细胞生物学行为的变化。

结果:（1）过表达microRNA-451a后,CCK8检测A549细胞的增殖能力被抑制,差异具有统计学意义（P<0.05）;克隆形成实验结果显示,过表达microRNA-451a组的克隆形成数（100.30±10.03个/平皿）较oe-NC组（174.21±10.30个/平皿）细胞增殖数目明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）;划痕修复实验结果显示,microRNA-451a组（34.19±2.13%）比oe-NC组（50.06±4.23%）迁移率降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;Transwell迁移和侵袭实验结果显示,过表达microRNA-451a组（20.70±1.59个/视野）较oe-NC组（79.45±6.09个/视野）细胞迁移数目明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）,而过表达microRNA-451a组（50.47±3.90个/视野）较oe-NC组（98.50±7.31个/视野）细胞侵袭数目明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。

（2）Targetscan和miRDB预测microRNA-451a和YWHAZ存在结合位点,并在microRNA-451a过表达的A549细胞株中,YWHAZ mRNA表达水平明显下降。

（3）沉默YWHAZ后,CCK8检测A549细胞的增殖能力被抑制,差异具有统计学意义（P<0.05）;克隆形成实验结果显示,si-YWHAZ组的克隆形成数（35.11±2.35个/平皿）si-NC组（56.67±4.75个/平皿）细胞增殖数目明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。

参考文献

[1]Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].Freddie Bray BSc,MSc,PhD,Jacques Ferlay ME,Isabelle Soerjomataram MD,MSc,PhD,Rebecca L.Siegel MPH,Lindsey A.Torre MSPH,Ahmedin Jemal PhD,DVM.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2018(6)

[2]MicroRNA-375 Suppresses the Tumor Aggressive Phenotypes of Clear Cell Renal Cell Carcinomas through Regulating YWHAZ[J].Xiang Zhang,Nai-Dong Xing,Cheng-Jun Lai,Rui Liu,Wei Jiao,Jue Wang,Jie Song,Zhong-Hua Xu.Chinese Medical Journal.2018(16)

[3]MiR-613 functions as tumor suppressor in hepatocellular carcinoma by targeting YWHAZ[J].Xuemei Jiang,Jinsheng Wu,Yingai Zhang,Sunlan Wang,Xiangnan Yu,Rong Li,Xiaoxi Huang.Gene.2018

[4]The ASH1-miR-375-YWHAZ Signaling Axis Regulates Tumor Properties in Hepatocellular Carcinoma[J].Juan-Feng Zhao,Qiu Zhao,Hui Hu,Jia-Zhi Liao,Ju-Sheng Lin,Chao Xia,Ying Chang,Jing Liu,An-Yuan Guo,Xing-Xing He.Molecular Therapy-Nucleic Acids.2018

[5]刘娅.microRNA-451a/YWHAZ调控肺腺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的实验研究[D].遵义医科大学,2020.