小鼠LEWIS肺癌细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠LEWIS肺癌细胞是小鼠来源的肺腺癌细胞，是分离自小鼠肺腺癌组织的稳定细胞系。肺腺癌（lung adenocarcinoma）是肺癌的一种，属于非小细胞癌。不同于鳞状细胞肺癌，肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者。起源于支气管粘膜上皮，少数起源于大支气管的粘液腺。发病率比鳞癌和未分化癌低，发病年龄较小，女性相对多见。多数腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌。早期一般没有明显的临床症状，往往在胸部X线检查时被发现。表现为圆形或椭圆形肿块，一般生长较慢，但有时早期即发生血行转移。淋巴转移则发生较晚。

细胞培养方法：

细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

应用^[4][5]

用于黄芪多糖联合顺铂对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及机制研究

实验分体外（细胞）、体内（动物）实验两部分进行研究。（1）体外实验通过噻唑蓝比色法（MTT）观察了不同浓度的APS对小鼠Lewis肺癌细胞（LLC）生长的影响;激光共聚焦显微镜（LSCM）下检测不同浓度的APS对LLC细胞骨架、线粒体膜电位（MMP）及细胞内Ca2+浓度的动态变化。

（2）动物实验部分主要通过LLC荷瘤小鼠模型,以低、中、高剂量APS及与减半剂量的DDP联合使用后对其进行干预,在计算抑瘤率的基础上,计算荷瘤小鼠的瘤质量、体质量、有效体质量等变化,并运用酶联免疫吸附法（ELISA）、荧光定量聚合酶链反应（Q-PCR）、免疫组织化学（SP）、蛋白免疫印迹（WB）等方法研究其对瘤组织细胞生长、细胞因子及DDP所致免疫功能低下的影响;核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的信号通路相关分子表达的影响;肿瘤组织Caspase-9、Bcl-2、Bax、Fas L等凋亡相关基因和蛋白表达的影响;血清Ⅳ型胶原蛋白（Col4）和透明质酸（HA）含量等表达的影响。

1. MTT显示:终浓度为50μg/ml400μg/ml的APS各时间点均可不同程度的抑制小鼠LLC的增殖（P<0.05）,以APS 200μg/ml作用最显著。

2. LSCM显示:（1）APS各剂量组中LLC的微管、微丝排列早期出现分布变化,晚期数量减少,断裂、塌陷,荧光着色变浅（P<0.05）。

（3）APS各剂量组在24、48、72h的时间点上,均可以明显降低小鼠LLC的MMP、升高细胞内Ca2+浓度（P<0.05）,两者均在24 h内变化最明显,即早期作用显著。这可能是其促进肿瘤细胞发生凋亡的机制之一。

3. 中、高剂量APS及联合用药各组对Lewis肺癌小鼠均有显著的抑瘤作用（P<0.05）,并可明显改善Lewis肺癌小鼠的体质量、有效体质量、瘤质量（P<0.05）,以联合用药组作用更为显著。q值在0.851.15之间,提示APS与减半剂量的DDP联合使用,疗效具有相加效应。

4.APS及联合用药各组可提高Lewis肺癌小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平（P<0.05）;提高实验小鼠的胸腺指数和脾脏指数,说明APS能增强DDP所致免疫功能低下小鼠的免疫功能,对免疫器官有一定的保护作用。

参考文献

[1]Caspases Connect Cell-Death Signaling to Organismal Homeostasis[J].Lorenzo Galluzzi,Alejandro López-Soto,Sharad Kumar,Guido Kroemer.Immunity.2016(2)

[2]Cytotoxic macrophage-released tumour necrosis factor-alpha（TNF-α）as a killing mechanism for cancer cell death after cold plasma activation[J].Nagendra Kumar Kaushik,Neha Kaushik,Booki Min,Ki Hong Choi,Young June Hong,Vandana Miller,Alexander Fridman,Eun Ha Choi.Journal of Physics D:Applied Physics.2016(8)

[3]Structural differences in diarylheptanoids analogues from Alnus viridis and Alnus glutinosa influence their activity and selectivity towards cancer cells[J].Jelena Dini?,Miroslav Novakovi?,Ana Podolski-Reni?,Vlatka Vajs,Vele Te?evi?,Aleksandra Isakovi?,Milica Pe?i?.Chemico-Biological Interactions.2016

[4]Pseudomonas aeruginosa ExoT Induces Mitochondrial Apoptosis in Target Host Cells in a Manner That Depends on Its GTPase-activating Protein（GAP）Domain Activity[J].Wood Stephen J.,Goldufsky Josef W.,Bello Daniella,Masood Sara,Shafikhani Sasha H..Journal of Biological Chemistry.2015(48)

[5]明海霞.黄芪多糖联合顺铂对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及机制研究[D].甘肃农业大学,2016.