稳定细胞株构建的应用

背景^[1-3]

稳定细胞株构建适用于各种研究应用，如重组蛋白和抗体生产、基因编辑、功能性研究等。

构建稳定细胞系的基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，常用G418来代替新霉素进行选择性筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。

稳定细胞株的构建周期长、难度大，每一步都很关键，尤其是细胞转染，常用物理方法（电转）、化学方法（脂质体等）、生物方法（病毒），根据不同的实验条件，选择的方法，来达到实验目的。

目的蛋白的过表达往往是研究该基因/蛋白功能的常规手段，也是借助表达系统富集蛋白（DHFR、GS system）的方法。蛋白过表达稳定细胞株的构建能很好的帮助研究这个蛋白，或者得到大量的目的蛋白。

主要包含如下步骤:

1.载体构建（表达质粒载体、病毒载体）；

2.转染/感染；

3.目的蛋白初步检测；

4.抗生素筛选；

5.目的蛋白再次检测（定性/半定量）；

6.单克隆细胞株稳定性检测。

应用^[4][5]

用于慢病毒法建立表达外源基因的人前列腺癌稳定细胞株研究

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是真核细胞信号传导的重要通路,其中p38作为该家族的亚族之一,参与了细胞内如应激反应、增殖、凋亡等多种生物学过程。在前列腺痛发生、发展的过程中,目前研究发现多种治疗基因通过p38MAPK通路诱导前列腺癌细胞凋亡。

因此设计将外源性的p38MAPK导入细胞内,并使细胞稳定持续表达,观察该基因过表达时对细胞生长增殖的影响,同时为未来通过该通路的治疗靶点研究提供了工具。将外源基因转入宿主细胞并使其表达的过程中,外源性目的基因的携带载体选择成为最关键的技术环节。

目前基因治疗中转入基因的载体大体上可以分为两大类：即病毒载体和非病毒载体。非病毒载体常用的方法包括电转移法、磷酸钙共沉淀法以及脂质体法,可以达到瞬时表达的效果。但瞬时表达系统的外源基因表达会随细胞生长繁殖而逐渐降低,且无法传至子代细胞。病毒载体目前常用的包括腺病毒载体,腺相关病毒载体以及慢病毒载体。

其中慢病毒载体改造自逆转录病毒,具有以下特点：、慢病毒载体既能转导分裂细胞又能转导非分裂细胞；第二、目的基因高效的整合于宿主细胞基因组内实现长期而稳定的表达并可以传代给子代细胞；第三、不会引起宿主免疫反应；第四,去除了原病毒复制的关键位点,提高了生物安全性。

对于前列腺癌的动物实验中,如何监测肿瘤细胞或者肿瘤组织的发生发展的过程成为亟待解决的问题,目前常见的方法包括荧光蛋白法和生物发光法。荧光蛋白作为报告基因,在生物学领域具有广泛的应用领域,成为细胞内分子影像的主流技术。

参考文献

[1]Applications of bioluminescence imaging to antiviral research and therapy:multiple luciferase enzymes and quantitation.Luker K E,Luker G D.Antiviral Research.2008

[2]A capsid-modified helper-dependent adenovirus vector containing the beta-globin locus control region displays a nonrandom integration pattern and allows stable,erythroid-specific gene expression.Wang H,Shayakhmetov DM,Leege T,et al.Journal of Virology.2005

[3]Firefly luciferase and RLuc8 exhibit differential sensitivity to oxidative stress in apoptotic cells.Czupryna J,Tsourkas A.PLoS One.2011

[4]A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals.Puaux A L,Ong L C,Jin Y,et al.Int J Mol Imaging.2011

[5]荆玉明.慢病毒法建立表达外源基因的人前列腺癌稳定细胞株[D].南方医科大学,2012.