P388细胞的应用

背景^[1-3]

P388细胞是小鼠白血病悬浮细胞，细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌，培养条件；RPMI-1640+10%FBS；37℃，5%CO2。

传代方法：

1.用75%酒精喷洒整个培养瓶消毒，将其平躺置于培养箱中进行1-3小时的缓冲，.然后置于无菌操作台，打开瓶口，将其中的培养液去掉，再往其中加入5-6mL新鲜培养基并置于细胞培养箱中培养，根据细胞生长状况及培养基颜色变化对其进行换液以及传代，一般2天换一次液；

2.待细胞长满瓶底面积70-80%，需要对其进行传代，传代比例为1:3-1：5；

3传代步骤：将0.25%胰酶-0.53 mM EDTA消化液置于37℃预热，倒掉培养瓶中的培养基，往培养瓶中加入3-5 ml PBS，轻晃洗涤后弃去。往瓶中加1-2 ml预热好的胰酶，置于室温孵育消化（次消化需置于显微镜下观察，以显微镜下细胞触角回收变圆、轻拍瓶壁见细胞脱落为消化时间，记录消化时间，以便于下次消化），消化好后加入3ml完全培养基终止消化。用移液枪轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后收集细胞悬液，1000rpm离心3min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，进行传代。

应用^[4][5]

用于复方解毒化瘀中药逆转P388/VCR细胞裸鼠模型P-gp表达的实验研究

通过建立P388/VCR细胞白血病多药耐药动物模型,并抽取腹水、外周血液及骨髓涂片,与正常对照组比较,以白血病细胞数鉴定动物模型是否成功；以白血病多药耐药裸鼠模型用药后情况、动物模型生活质量等判定复方解毒化瘀中药大、中、小剂量组与长春新碱配伍使用逆转白血病多药耐药效应,通过检测白血病细胞多药耐药蛋白（P-gp）,以探索复方解毒化瘀中药逆转白血病多药耐药可能的分子生物学机制。

方法：（1）细胞的培养：分别将白血病细胞株P388及白血病细胞耐药株P388/VCR置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中,在37℃、饱和湿度、5%C02条件下培养传代。分别取对数生长的白血病细胞,在无菌条件下给每只裸鼠腹腔直接接种0.2m1（浓度为1×107个/ml）细胞悬液,待腹水瘤摸型建立后,将裸鼠随机分成正常对照组、模型组、长春新碱治疗组、实验1组（大剂量复方解毒化瘀中药+长春新碱组）、实验2组（中剂量复方解毒化瘀中药+长春新碱组）、实验3组（小剂量复方解毒化瘀中药+长春新碱组）共6组,分别给裸鼠蒸馏水、生理盐水灌胃,长春新碱腹腔注射,大、中、小剂量的中药灌胃联合腹腔注射长春新碱,体积均为0.1ml/10g体重。其中,长春新碱2天给药1次,连续5次；复方解毒化瘀中药每天给药1次,连续用药10天。在实验过程中每2天检查1次外周血象。造模型前、给药后动态观察各组裸鼠精神、饮食及体重变化,注意腹水、瘤块形成情况及裸鼠生存情况。

（2）采用MTT法分别检测体外、体内P388/VCR耐药细胞的耐药倍数。

（3）白血病细胞数：分别取造模裸小鼠外周血、腹水离心（离心的细胞用25μl胎牛血清混匀）及裸鼠胸骨骨髓用25μl胎牛血清混匀,迅速涂片,吉姆萨染色,油镜下观察细胞形态,按细胞形态计算白血病细胞（原始+早幼粒细胞）百分比,鉴定动物模型是否成功。

（4）实验结束前根据裸鼠的精神、饮食状况以及抽取裸鼠腹水、外周血或胸骨骨髓涂片,观察腹水、外周血及骨髓原始+早幼粒细胞百分比,P-gp的表达情况,并测量裸鼠瘤块体积,观察白血病耐药细胞株裸鼠模型缓解情况。

（5）于停止给药、给水次日抽取裸鼠外周血,用流式细胞术对裸鼠外周血进行荧光标记检测,观察结果判断白血病耐药细胞株P388/VCR中耐药蛋白P-gp的表达。

参考文献

[1]Expression of L-selectin and efficient binding to high endothelial venules do not modulate the dissemination potential of murine B-cell lymphoma[J].Ronit Aviram,Nava Raz,Tova Kukulansky,Nurit Hollander.Cancer Immunology,Immunotherapy.2001(2)

[2]Are selectins involved in metastasis?[J].T.Krause,G.A.Turner.Clinical and Experimental Metastasis.1999(3)

[3]Specific reversal of MDR1/P-gp-dependent multidrug resistance by RNAinterference in colon cancer cells[J].Zhongsheng Xia,Zhaohua Zhu,Liyong Zhang,Crista Royal,Zhongmin Liu,Qikui Chen,Bao-Ling Adam.Oncology Reports.2008(6)

[4]P-glycoprotein plays a drug-efflux-independent role in augmenting cell survival in acute myeloblastic leukemia and is associated with modulation of a sphingomyelin-ceramide apoptotic pathway.Pallis M,Russell N.Blood.2000

[5]夏成玉.复方解毒化瘀中药逆转P388/VCR细胞裸鼠模型P-gp表达的实验研究[D].贵阳中医学院,2014.