NH4 + 对 L-色氨酸发酵的影响

L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，是人体和动物生命活动中必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等方面。目前利用微生物生产L-色氨酸的方法主要有酶法、微生物转化法和微生物发酵法，其中微生物发酵法是大规模生产 L-色氨酸的首选技术， 现常用菌株有大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌。大肠杆菌具有生长速度快、培养成本低、遗传背景清楚、易实现高密度培养等优点，因而重组大肠杆菌得到广泛地应用。发酵法生产 L-色氨酸的过程中需要加碱调节pH 来维持菌体的最适生长。目前能实现工艺要求的 pH 调控剂主要有钠盐、钙盐、镁盐以及浓氨水，前三者有试剂消耗量大、价格昂贵、下游提取工艺复杂等缺点，而采用氨水调节 pH，不需要消耗大量的试剂，生成的副产物少，具有闭合、清洁、廉价和高效等优点。

大肠杆菌高密度发酵条件下， 细胞产生大量的乙酸和 CO2，可使 pH 值显著降低， 需要通过自动流加氨水控制 pH 在 7，铵盐可以作为发酵过程中的营养物和缓冲剂，但高浓度的 NH4 + 会严重抑制大肠杆菌的生长。研究了 NH4 + 对重组大肠杆菌 E． coli  TRTH发酵生产 L-色氨酸的影响，分析了 NH4 + 对菌体抑制作用的机理，确定了 L-色氨酸发酵过程中的最适 NH4 + 浓度，显著提高了菌体生物量与 L-色氨酸产量。

L-色氨酸发酵过程分析

在 30 L 自控发酵罐上进行补料分批发酵，每隔 2 h测定菌体生物量、L-色氨酸产量、NH4+ 浓度及比生长速率等参数。

由图 1 可知，NH4 + 大约从 6 h 时开始积累， 且随着菌体比生长速率的增大迅速积累， 20 h 达到值190． 32mmol /L， 随后 NH4 + 逐渐被消耗， 基本维持在150mmol /L。0 ～ 6h， 菌体不产酸， 发酵液的 pH 保持稳定，不需流加氨水， 进入对数期后， 菌体开始产酸需流加氨水来维持 pH 值，随着氨水的补入， 发酵液中的NH4+ 累积浓度逐渐增大，当 NH4 + 浓度高于 170 mmol /L 时会严重抑制大肠杆菌的生长，导致产酸受阻 。由此可见，L-色氨酸发酵过程中 NH4 + 的积累主要表现在对数生长期中后期，因此有必要考察 NH4 + 浓度对 L-色氨酸发酵中后期的影响。

 NH4+ 对 L-色氨酸发酵的影响

控制 NH4 + 浓度在 120 mmol /L 以下及在发酵 14 h 后向发酵培养基中添加 0、2、5 g /L 的硫酸铵， 考察不同 NH4 + 浓度对菌体生长和 L-色氨酸产量的影响( 图 2) 。从图 2 可以看出，与未添加硫酸铵相比，14 h 添加2 g /L 与 5 g /L 硫酸铵L-色氨酸发酵过程中 NH4 + 的累积浓度分别达到256． 67 mmol /L 和 327． 51 mmol /L，对菌体生长和 L-色氨酸均有明显的抑制作用， 且抑制程度随着 NH4 + 浓度的增加而增强。其中硫酸铵添加量为 2 g /L 时，菌体生物量和 L-色氨酸产量分别下降23． 85% 和 17． 71% ; 硫酸铵添加量为 5g /L 时， 菌体生物量和 L-色氨酸产量仅为 22． 39 g /L，20． 12 g /L，分别下降了 35． 01% 和 25． 73% 。

NH4+ 对 L-色氨酸发酵过程的抑制还表现在使菌体过早的衰老、自溶， 未添加硫酸铵时，26 h 后菌体进入稳定期; 添加 2 g /L 硫酸铵时，24h 后菌体进入稳定期; 而添加 5 g /L 硫酸铵时，21 h 后菌体就基本就进入稳定期，25 h 后菌体生物量下降， 细胞开始自溶，进入衰退期; 控制 NH4 + 浓度在 120 mmol /L 以下时， 菌体对数生长期延长至 30 h，比生长速率和比产酸速率增大，菌体生物量和 L-色氨酸产量分别提高 12．16% 和19． 80% 。

NH4+ 对 L-色氨酸发酵过程中有机酸积累的影响

利用液相色谱法对不同 NH4 +浓度发酵液的有机酸组成进行分析( 图 3) 。随着发酵液中 NH4 + 浓度的增大，L-色氨酸发酵过程中有机酸含量均有不同程度的增加，但增幅不大。未添加硫酸铵时， L-色氨酸发酵过程中丙酮酸、乳酸、乙酸的累积浓度分别为 0． 04g /L 、0． 23g /L 和 2． 46g /L; 添加 2g /L硫酸铵时为 0． 06g /L、0． 42g /L 和 3． 06g /L; 添加 5g /L 时为0． 07g /L、0． 54g /L和 3． 31g /L; 控制 NH4 + 浓度在 120mmol /L 以下时为0． 21g /L、0． 03g /L 和 2． 23g /L。

NH4+ 对 L-色氨酸发酵过程耗糖速率的影响

在 30 L 自控发酵罐上进行补料分批发酵，每隔 2 h测定发酵液中葡萄糖浓度( 图4) 。测定结果表明，随着NH4+ 浓度的增加， 菌体耗糖速率减慢。由此可见， 说明 NH4 + 影响大肠杆菌对糖类的代谢。

 讨 论

重组大肠杆菌高密度发酵技术已在生产实践中得到了广泛应用，并取得一定成果，但是该技术在实际应用中也存在许多需要解决的问题， 其中最为严重的是培养过程中菌体过早的衰老、自溶、比活性较低， 这主要是由于细菌产生的有害代谢物对重组菌存在抑制作用。高浓度的 NH4 + 对细胞生长有抑制作用，主要表现为 NH4 + 浓度增高所产生的毒化作用和 pH 值上升改变细胞生长环境这两方面， pH 值的改变降低了胞外营养物质的解离度和细胞膜的通透性，干扰了菌体的初级代谢，进而影响菌体的生长和产物的合成。叶贵子等通过选育耐铵型产琥珀酸放线杆菌， 使得琥珀酸产量比出发菌提高180． 5% 。郑梦杰等通过检测链霉菌发酵过程中相关酶的活力，发现培养基中的 NH4 + 通过作用于糖代谢过程中的多个位点实现对细胞合成代谢的抑制， 总体致使 PP途径减弱， NADPH 生成速率减慢， TCA 循环加强。

发酵生产 L-色氨酸的代谢流量分析结果表明， NH4 + 浓度的增加，造成 EMP 途径的代谢流量增加 7．31% ， PP 途径的代谢流降低 7． 14% ， TCA 循环的代谢流量增加22． 04% 。PP 途径流量减小，NADPH 生成速率减慢，TCA 循环加强， 能量代谢速率加快， 造成胞内 ATP 积累，ATP 积累至一定浓度时，可反馈抑制 EMP 途径中某些酶的活性，降低糖的酵解速率， 从而影响细胞的生长和某些代谢产物的合成。       

利用 NaOH 和氨水混合补料，控制 NH4 + 浓度在120 mmol /L 以下，解除了 NH4 + 对菌体生长和产物生成的抑制，使得菌体生物量和 L-色氨酸产量大幅提高，且实现了高密度发酵培养， 这对工业化发酵生产 L-色氨酸提供了理论依据并具有一定实用价值。