鲁索利替尼的制备方法
发布日期:2021/1/7 15:03:24
背景及概述[1]
鲁索利替尼Ruxolitinib（又称芦可替尼）是一种激酶抑制剂，用于治疗中间或高危骨髓纤维化,包括原发性骨髓纤维化，真性红细胞增多症后骨髓纤维化和原发性血小板增多症后骨髓纤维化患者。鲁索利替尼（ruxolitinib，Jakavi）是一种口服JAK1和JAK2酪氨酸激酶抑制剂，于2012年8月获欧盟批准，用于治疗中级或高危骨髓纤维化，包括原发性骨髓纤维化，真性红细胞增多症后骨髓纤维化和原发性血小板增多症后骨髓纤维化。目前，鲁索利替尼Jakavi已获全球50多个国家批准，包括欧盟、加拿大和一些亚洲、拉丁美洲和南美洲国家。诺华从Incyte公司授权获得鲁索利替尼Ruxolitinib在美国以外的开发和商业化权利。欧盟委员会和FDA均已授予鲁索利替尼Ruxolitinib治疗骨髓纤维化的孤儿药地位。目前，Incyte已经在美国以商品名Jakafi销售，用于中级或高危骨髓纤维化的治疗。真性红细胞增多症（polycythemiavera，PV）是一种慢性、无法治愈的血液癌症，该病与血细胞生产过剩相关，导致血液增稠，血液凝块风险增加。这些血凝块可导致严重心血管并发症，如中风和心脏病发作，从而增加病发率和死亡率。红细胞增多症患者，常有脾脏肿大及额外衰弱的症状。许多患者经常规治疗后会变得不耐受或抵抗，这与病情恶化的风险升高有关。
制备[2]
步骤1：环戊基甲醛(化合物2)的制备
称取溴代环戊烷若干，少量溶于5倍体积无水THF中，加入镁屑(1eq)，催化量碘单质，氮气保护，升温至40℃左右引发反应，控温30～40℃滴加溴代环戊烷，滴完，保温搅拌1～2h，控温10℃以下滴加DMF(1.05eq)，滴完后，室温30℃搅拌1h，向料液中加入3倍体积的MTBE，0℃以下滴加3N稀盐酸调pH3～4，分液，水层用MTBE提取两次(每次用3倍体积)，至产物基本提出，合并有机相，饱和盐水洗涤两次，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩至干，得粗品环戊基甲醛，收率90％～95％，直接用于下一步反应。
步骤2：3-环戊基丙烯酸甲酯(化合物3)的制备
称取叔丁醇钾(1.05eq)，溶于10倍体积的无水THF中，氮气保护，0℃左右，向料液中滴加磷酰基乙酸三甲酯(1.1eq)，滴完，保温0℃左右，搅拌反应2～3h，称取环戊基甲醛若干，配制成2倍体积无水THF溶液，0℃左右滴加到上述料液中，滴完后，升至室温30℃左右搅拌反应12～15h，反应完。料液中加入5倍体积MTBE稀释，10倍体积水，分液，水层分别用3倍体积的MTBE反萃两次，饱和盐水洗涤两次，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得粗品3-环戊基丙烯酸甲酯，收率85％～90％，直接用于下一步反应。
步骤3：3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸甲酯(化合物4)的制备
称取3-环戊基丙烯酸甲酯若干，溶于5倍体积的乙腈中，料液加入4-溴吡唑(1.1eq)，DBU(1.5eq)，加完，料液室温30℃搅拌反应约12～16h，原料反应完全。减压浓缩小体积，料液中加入5倍体积MTBE稀释，水洗，1N稀盐酸调pH3～4洗涤，水洗，饱和盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得粗品3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸甲酯，收率90～95％，直接用于下一步水解。
步骤4：3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸(化合物5)的制备
称取3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸甲酯若干，溶于6倍体积的THF中，料液加入氢氧化锂一水合物(1.2eq)3倍体积水溶液，加完，料液室温30℃搅拌反应1～2h，原料反应完全。料液加入5倍体积的MTBE稀释，料液加入1N稀盐酸调pH3～4，分液，水层用3倍体积的MTBE反萃两次，合并有机相，水洗涤、饱和NaCl液洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得粗品3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸，收率85％～90％，直接用于下一步拆分。
步骤5：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸(化合物6)的制备
称取3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸若干，溶解于5倍体积的异丙醇中，再向该料液中加入(1S,2R)-1-氨基-2-茚醇(0.9eq)的3倍体积异丙醇溶液，料液室温搅拌12-15h，过滤固体。固体粗品用5倍体积异丙醇重结晶，料液缓慢冷却析晶，过滤固体，固体粗品用5倍体积异丙醇重结晶，料液缓慢冷却析晶，过滤固体，烘干检测光学纯度高于99％，化学纯度高于99％，收率30～35％。
称取上述烘干固体若干，加入4倍体积的MTBE，加入用1N稀盐酸先调节PH至3～4左右，分液，水层用3倍体积MTBE反萃。合并有机相，水洗涤，饱和盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得粗品(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸，收率90％～95％，HPLC纯度高于99％。
该步产物核磁数据如下：1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:1.03～1.12(1H,m),1.16～1.27(1H,m),1.33～1.40(1H,m),1.41～1.70(4H,m),1.83～1.90(1H,m),2.33～2.44(1H,m),2.87(1H,dd,J＝16.0,4.0Hz),3.13(1H,dd,J＝16.0,12.0Hz,),4.21～4.26(1H,m),7.44(1H,s),7.48(1H,s).
步骤6：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸(化合物6)的制备
称取3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸若干，溶解于5倍体积的异丙醇中，再向该料液中加入S-苯乙胺(0.9eq)的3倍体积异丙醇溶液，料液室温搅拌12-15h，过滤固体。固体粗品用5倍体积异丙醇重结晶，料液缓慢冷却析晶，过滤固体，固体粗品用5倍体积异丙醇重结晶，料液缓慢冷却析晶，过滤固体，烘干检测光学纯度高于99％，化学纯度高于99％，收率10～15％。
称取上述烘干固体若干，加入4倍体积的MTBE，加入用1N稀盐酸先调节pH至3～4左右，分液，水层用3倍体积MTBE反萃。合并有机相，水洗涤，饱和盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得粗品(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸，收率90％～95％，HPLC纯度高于99％。
步骤7：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸(化合物6)的制备
称取3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸若干，溶解于5倍体积的异丙醇中，再向该料液中加入奎宁(0.9eq)的5倍体积异丙醇溶液，料液室温搅拌12-15h，过滤固体。固体粗品用10倍体积异丙醇重结晶，料液缓慢冷却析晶，过滤固体，固体粗品再次用10倍体积异丙醇重结晶，过滤固体，固体粗品再次用10倍体积异丙醇重结晶，料液缓慢冷却析晶，过滤固体，烘干检测光学纯度高于99％，化学纯度高于99％，收率10～15％。
称取上述烘干固体若干，加入4倍体积的MTBE，加入用1N稀盐酸先调节PH至3～4左右，分液，水层用3倍体积MTBE反萃。合并有机相，水洗涤，饱和盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得粗品(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸，收率90％～95％，HPLC纯度高于99％。
步骤8：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸(化合物6)的制备
称取3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸若干，溶解于5倍体积的异丙醇中，再向该料液中加入辛可尼丁(0.9eq)的5倍体积异丙醇溶液，料液室温搅拌12-15h，过滤固体。固体粗品用10倍体积异丙醇重结晶，料液缓慢冷却析晶，过滤固体，固体粗品再次用10倍体积异丙醇重结晶，过滤固体，固体粗品再次用10倍体积异丙醇重结晶，料液缓慢冷却析晶，过滤固体，烘干检测光学纯度高于99％，化学纯度高于99％，收率5～10％。
称取上述烘干固体若干，加入4倍体积的MTBE，加入用1N稀盐酸先调节PH至3～4左右，分液，水层用3倍体积MTBE反萃。合并有机相，水洗涤，饱和盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得粗品(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸，收率90％～95％，HPLC纯度高于99％。
步骤9：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酰胺(化合物7)的制备
称取(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酸若干，溶于4倍体积干燥四氢呋喃中，加入羰基二咪唑(3eq)，氮气保护，室温反应3h，原料反应完全。料液通氨气约30分钟，料液加入4倍体积的MTBE稀释，料液加入4倍体积的水分液，水层用3倍体积的MTBE反萃，合并有机相，水洗涤，饱和盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得粗品(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酰胺，10倍体积正庚烷打浆得白色固体，收率90～95％，HPLC98％以上。
所得产物核磁数据如下：1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:1.03～1.13(1H,m),1.20～1.30(1H,m),1.33～1.41(1H,m),1.43～1.71(4H,m),1.79～1.87(1H,m),2.31～2.43(1H,m),2.68(1H,dd,J＝16.0,4.0Hz),2.94(1H,dd,J＝16.0,8.0Hz),4.26～4.32(1H,m),5.36(1H,brs),5.52(1H,brs),7.43(1H,s),7.74(1H,s)
步骤10：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙腈(化合物8)的制备
称取(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙酰胺若干，溶于4倍体积干燥四氢呋喃中，加入五氧化二磷(3eq)，氮气保护，升温60～70℃反应1～2h，原料反应完全。料液加入4倍体积的MTBE稀释，料液加入4倍体积的饱和碳酸氢钠淬灭，分液，水层用3倍体积的MTBE反萃，合并有机相，水洗涤，饱和盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得粗品(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙腈，收率90％～95％，直接用于下一步反应。
该步产物核磁数据如下：1HNMR(CDCl3,400MHz)δ:1.08～1.17(1H,m),1.18～1.27(1H,m),1.44～1.76(5H,m),1.87～194(1H,m),2.42～2.52(1H,m),2.86(1H,dd,J＝16.0,4.0Hz),3.02(1H,dd,J＝16.0,8.0Hz),4.08～4.14(1H,m),7.51(1H,s),7.52(1H,s).
步骤11：(R)-3-(4-硼酸-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙腈(化合物9)的制备
称取(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙腈若干，溶于4倍体积干燥四氢呋喃中，氮气保护，料液降温-15℃，向料液中滴加异丙基氯化镁(1.15eq)，加完，料液-5℃～5℃搅拌反应1h，控制温度-5℃以下，滴加干燥的硼酸三异丙酯(1.05eq)，滴完后，-5～5℃反应1～2h，反应完全，料液加入4倍体积的MTBE稀释，料液加入4倍体积的饱和氯化铵淬灭，分液，水层用3倍体积的MTBE反萃，合并有机相，水洗涤，饱和盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得粗品(R)-3-(4-硼酸-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙腈，10倍体积正庚烷打浆得白色固体，收率85％～90％，HPLC98％以上。
该步产物核磁数据如下：1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ:1.02～1.12(1H,m),1.19～1.29(2H,m),1.36～1.61(4H,m),1.72～1.80(1H,m),2.26～2.37(1H,m),3.02～3.15(2H,m),4.36～4.42(1H,m),7.73(1H,s),7.76(2H,brs),7.92(1H,s).
步骤12：6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-(双叔丁氧碳基)基胺(即化合物10)的制备
具体步骤如下：
(1)称取POCl3(4eq)加入反应瓶中，氮气保护下，冷却至0℃左右，向料液中加入DMF(1.85eq)，滴加时，控温于0～8℃，加完，料液0～10℃，搅拌1h，向料液中加入4,6-二羟基嘧啶，加完，料液自然升温至室温，搅拌1h，然后升温至回流，搅拌2h，料液冷却，搅拌过夜。料液减压蒸去多余的POCl3，残余物缓慢加入冰水中，用乙酸乙酯提取产物(2倍体积*3)，合并有机相，水洗(2倍体积)，饱和碳酸氢钠溶液洗涤(2倍体积)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得粗品4,6-二氯嘧啶-5-羧甲醛(yield:70％)，直接用于下一步反应。
(2)称取4,6-二氯嘧啶-5-羧甲醛若干，加入甲苯溶解(5倍体积)，向料液中加入7MNH3/MeOH溶液(3eq)，料液加热至60℃，搅拌反应1h，补加入NH3/MeOH溶液(1eq)，继续搅拌1h，TLC检测，原料基本反应完全。料液冷却至室温，减压浓缩蒸出溶剂，残余物中加入适量H2O(3倍体积)，搅拌，乙酸乙酯/正丁醇混合溶剂(V/V＝2/1)提取(4倍体积*2)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩干，得粗品4-氨基-6-氯嘧啶-5-羧甲醛(yield：100％)，直接投入下一步反应。
(3)称取(甲氧基甲基)三苯基-氯化膦若干(1.05eq)，加入THF(30倍体积)，搅拌，氮气保护下，降温至-5℃，向其中加入t-BuOK(1.05eq)，加完，料液0℃，搅拌1h。向上述料液分批加入4-氨基-6-氯嘧啶-5-羧甲醛，加完，料液自然升温至室温，搅拌反应30h，TLC检测，原料基本反应完全。料液冷却至0℃，加入饱和氯化铵液淬灭反应，料液中加入浓盐酸，调节PH至1～2，料液用乙酸乙酯提取(2倍体积*2，萃除杂质)，水层再用6NNaOH液调节pH至8～9，用乙酸乙酯提取(10倍体积*3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩得6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-基胺粗品(yield:60％)，直接用于下一步反应。
(4)称取6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-基胺若干，加入乙酸乙酯(15倍体积)，DMAP(0.2eq)，搅拌，向该料液中滴加入Boc2O(2.2eq)，加完，料液升温至45～50℃，搅拌反应2h，TLC检测，原料基本反应完全。料液冷却至0～5℃，1NHCl溶液洗涤(5倍体积)，饱和碳酸氢钠液洗涤(5倍体积)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-(双叔丁氧碳基)基胺粗品(E/Z＝5/1)，该粗品经乙酸乙酯/庚烷体系重结晶，得6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-(双叔丁氧碳基)基胺(E式)即化合物10(yield:60％)，类白色固体。
步骤13：(3R)-环戊基-3-[4-(5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-基胺)吡唑-1-基]丙腈(化合物11)的制备
称取(R)-3-(4-硼酸-1H-吡唑-1-基)-3-环戊丙腈(1eq)、6-氯-5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-(双叔丁氧碳基)基胺(1.03eq)、碳酸钾(3eq)、Pd(PPh3)4(3％eq)若干，加入反应瓶中，向瓶中加入THF(10倍体积)和H2O(2倍体积)，体系氮气置换3～4次，氮气保护下，料液加热至50～60℃，反应12～15h，原料基本反应完全。向料液中加入乙酸乙酯(10倍体积)和H2O(5倍体积)，搅拌，静置，分液，有机相H2O洗涤(3倍体积)，无水硫酸钠干燥，过滤(垫适量硅胶)，滤液减压浓缩干，得粗品(3R)-环戊基-3-[4-(5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-基胺)吡唑-1-基]丙腈(yield：96％)，直接用于下一步反应。
步骤14：(3R)-环戊基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)吡唑-1-基]丙腈(化合物12，即鲁索利替尼)的制备
称取上步粗品(3R)-环戊基-3-[4-(5-(2-甲氧基乙烯基)嘧啶-4-基胺)吡唑-1-基]丙腈若干，溶于THF溶液中(4倍体积)，向其中加入浓盐酸(2.2eq)，料液在室温搅拌2～3h，再升温至回流，搅拌反应5h，TLC检测，原料基本反应完全，料液冷却至室温，加入饱和NaHCO3溶液，调节pH至8～9，加入乙酸乙酯提取(10x)，有机相经水洗涤(3倍体积)，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得(3R)-环戊基-3-[4-(7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)吡唑-1-基]丙腈粗品(yield：90％)。
参考文献
[1][中国发明]CN201610409408.3一种鲁索利替尼制剂及其应用
[2][中国发明,中国发明授权]CN201610707767.7一种JAK抑制剂及其盐的制备方法
