SK-N-BE(2)细胞的应用

背景^[1-3]

SK-N-BE(2)细胞是于1972年11月从一位多次化疗及放疗的扩散性神经母细胞瘤患儿骨髓穿刺物中建立的；SK-N-BE(2)细胞显示中等水平的多巴胺-β-羟基酶活性。SK-N-BE(2)细胞的饱和浓度超过1×10^6细胞/cm^2。SK-N-BE(2)细胞形态多样，有的有长突触、有的呈上皮细胞样；SK-N-BE(2)细胞会聚集，形成团块并浮起。

神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外肿瘤，是婴幼儿最常见的肿瘤。有将近一半的神经母细胞瘤发生在2岁以内的婴幼儿。神经母细胞瘤约占6-10%的儿童肿瘤，15%的儿童肿瘤死亡率。对于4岁以下儿童，每一百万人口的死亡率为10；对于4-9岁儿童，每一百万人口的死亡率为4例。神经母细胞瘤属于神经内分泌性肿瘤，可以起源于交感神经系统的任意神经脊部位。其最常见的发生部位是肾上腺，但也可以发生在颈部、胸部、腹部以及盆腔的神经组织。

显微镜下，神经母细胞瘤呈现为蓝染的小圆形细胞，菊花形排列。肿瘤细胞围绕神经毡（neuropil）呈菊花形排列，与其他的肿瘤（如视神经母细胞瘤）围绕血管呈菊花形排列有所不同。其他还有一些神经母细胞瘤所特异的免疫组化染色，用以与其他肿瘤（尤因肉瘤，淋巴瘤等）进行鉴别诊断。

SK-N-BE(2)细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

应用^[4][5]

用于靶向抑制NACK对神经母细胞瘤SK-N-BE（2）细胞增殖、凋亡的影响及相关机制研究

用脂质体介导siRNA转染人神经母细胞瘤SK-N-BE（2）细胞下调NACK基因表达对细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。实验方法常规培养人神经母细胞瘤细胞SK-N-BE（2）。

根据相关实验设计并合成NACK siRNA、NC si RNA,通过脂质体介导siRNA转染SK-N-BE（2）细胞,根据处理SK-N-BE（2）细胞方式的不同分为:实验组（NACK siRNA组）、阴性对照组（NC siRNA组）和空白对照组（control组）。

在荧光显微镜下观测被转染的各组细胞的荧光情况;qRT-PCR、Western blot方法检测转染后NACK基因的沉默效率;CCK-8法检测各组细胞增殖抑制率;流式细胞术检测各组细胞凋亡的情况。最后再应用qRT-PCR、Western blot检测靶向抑制NACK表达后Notch1信号传导通路下游靶基因Hes1、c-Myc和n-Myc的表达情况。

结果脂质体介导siRNA转染人神经母细胞瘤SK-N-BE（2）细胞后细胞在荧光显微镜下呈绿色荧光。成功转染NACK siRNA的实验组细胞的NACK mRNA及其蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。

CCK-8法检测到实验组细胞增殖较阴性和空白对照组相比受到明显抑制（P<0.01）,流式细胞仪检测到实验组细胞凋亡亦较对照组明显增加（P<0.01）。

Western blot、qRT-PCR对Notch1信号通路下游相关靶基因Hes1、c-Myc和n-Myc的蛋白水平和m RNA表达检测发现较阴性对照组及空白对照组均明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。

参考文献

[1]Effect of dioscin on promoting liver regeneration via activating Notch1/Jagged1 signal pathway[J].Lina Xu,Lina Gu,Xufeng Tao,Youwei Xu,Yan Qi,Lianhong Yin,Xu Han,Jinyong Peng.Phytomedicine.2018

[2]Overexpression of Pofut1 and activated Notch1 may be associated with poor prognosis in breast cancer[J].Guoxing Wan,Lin Tian,Yuandong Yu,Fang Li,Xuanbin Wang,Chen Li,Shouheng Deng,Xiongjie Yu,Xiaojun Cai,Zhigang Zuo,Fengjun Cao.Biochemical and Biophysical Research Communicatio.2017(1)

[3]Common PHOX2B poly-alanine contractions impair RET gene transcription,predisposing to Hirschsprung disease[J].Eleonora Di Zanni,Annalisa Adamo,Elga Belligni,Margherita Lerone,Giuseppe Martucciello,Girolamo Mattioli,Alessio Pini Prato,Roberto Ravazzolo,Margherita Silengo,Tiziana Bachetti,Isabella Ceccherini.BBA-Molecular Basis of Disease.2017(7)

[4]The Varied Roles of Notch in Cancer[J].Jon C.Aster,Warren S.Pear,Stephen C.Blacklow.Annual Review of Pathology:Mechanisms of Disease.2017

[5]李林林.靶向抑制NACK对神经母细胞瘤SK-N-BE(2)细胞增殖、凋亡的影响及相关机制研究[D].青岛大学,2020.