谷氨酸变位酶与天冬氨酸-β-脱羧酶偶联催化L-谷氨酸合成L-2-氨基丁酸

图片来源：ACS Catal.

首先对纯化的GM进行了表征，在37℃时，催化L-glutamate转化为3-甲基天冬氨酸的比活力为7.5u/mg。同时，选择了一种来源于抗辐射不动杆菌的、对L-天冬氨酸具有高β-脱羧活性的Asd（ArAsd）作为促进3-甲基天冬氨酸转化为L-ABA的第二种酶。然而，由于底物的特异性，没有检测到WT-ArAsd对3-甲基天冬氨酸的活性，这也是氨基酸脱羧酶的一个显著特征。为了提高3-甲基天冬氨酸β-脱羧活性，在酶结构的基础上进行了对ArAsd分子改造。底物进入活性位点的通道有两个重要的氨基酸残基S486和K18，将K18变成A18后，在结构上通道口变大。

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为了进一步提高ArAsd对3-甲基天冬氨酸的活性，考虑对催化口袋进行进化。Asd属于I型PLP酶家族，将L-天冬氨酸转化为L-丙氨酸和CO₂，PLP共价结合在催化口袋的Lys315上，ArAsd中对应的残基为Lys314。因此，首先考虑PLP 5A范围内的残基。为了确定调控底物特异性的关键残基，对这些残基进行了丙氨酸扫描诱变，结果是双突变K18A/V287I的酶活最高。

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最终，以谷氨酸为唯一底物，通过GM与Asd的偶联反应，构建了合成L-2-氨基丁酸的级联反应。根据GM和K18A/V287I的特性，反应在pH 6.6和37℃下进行，培养4h后，L-谷氨酸（4.5mm）转化率为90%，检测到L-ABA的含量为4.45mM，L-谷氨酸转化为L-ABA的转化率高达98.9%。

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参考文献：Enzymatic Biosynthesis of L‑2-Aminobutyric Acid by Glutamate Mutase Coupled with L‑Aspartate-β-decarboxylase Using L‑Glutamate as the Sole Substrate

ACS Catal.

DOI：10.1021/acscatal.0c04141