小鼠组蛋白去乙酰化酶(HDAC)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠组蛋白去乙酰化酶(HDAC)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的浓度。往预先包被小鼠组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于小鼠植入前胚胎组蛋白乙酰基转移酶GCN5和去乙酰化酶HDAC1表达模式及体外培养对其表达影响研究

探讨常规体外培养体系对植入前胚胎表遗传性修饰的影响和胚胎体外培养时发生基因表达模式改变的可能机制,我们以染色质组蛋白乙酞化水平的重要调控酶一GCNS和HDACI为指标,应用逆转录聚合酶链反应和荧光免疫细胞化学,研究小鼠体内发育的植入前胚胎GCNS和HDACI的正常表达模式,并考察常规体外培养所获得的小鼠植入前胚胎GCNS和HDACI的表达变化。

阐明小鼠植入前胚胎GCNS和HDACI表达模式及常规体外培养对其表达影响,探讨常规体外培养体系对植入前胚胎表遗传性修饰的影响和胚胎体外培养时发生基因表达模式改变的可能机制。

研究对象为ICR小鼠植入前胚胎。一体内组经孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin·PMSG）超促排卵的雌性小鼠,注射人绒毛膜促性腺激素（human chorioniegonadotropin,HCG）后与雄鼠合笼,分别于注射HCG后（pHeG）43礴4h,58一60h,64一66h,75一soh,96一looh脱颈处死见阴栓小鼠,培养液冲洗输卵管或子宫直接获取2细胞、4细胞、8细胞卵裂胚胎,桑堪胚和囊胚。

体外组经PMSG超促排卵的雌性小鼠,注射HCG后与雄鼠合笼,pHCG24一26h脱颈处死见阴栓小鼠,培养液冲洗输卵管获取双原核期胚胎,用Pl和囊胚培养液行序贯培养,并分别于pHCG 4648h、60一62h、72一74h、96一100h、118一122h,从培养系统中收集2细胞、4细胞、8细胞卵裂胚胎,桑堪胚和囊胚。

RT-PCR法和荧光免疫细胞化学法分别测定GCNS、HDACI mRNA和蛋白表达,并进行组内不同时期胚胎及组间相应时期胚胎GCNS、HDACI表达水平的比较。结果Rl’-PCR（1）GCNS和HDACI在两组各时期胚胎中均有表达。

参考文献

[1]Wnt7b regulates mesenchymal proliferation and vascular development in the lung.Weiguo Shu,Yue Qin Jiang,Min Min Lu,Edward E.Morris.Development.2002

[2]Diet-induced lethality due to deletion of the Hdac3 gene in heart and skeletal muscle.Sun,Zheng,Singh,Nikhil,Mullican,Shannon E,Everett,Logan J,Li,Li,Yuan,Lijun,Liu,Xi,Epstein,Jonathan A,Lazar,Mitchell A.Journal of Biological Chemistry.2011

[3]beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis.ML Mucenski,SE Wert,JM Nation,DE Loudy,J Huelsken,W Birchmeier,EE Morrisey,JA Whitsett.Journal of Biological Chemistry.2003

[4]HDAC3 controls gap 2/mitosis progression in adult neural stem/progenitor cells by regulating CDK1 levels.Jiang Y,Hsieh J.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2014

[5]赵冬梅.小鼠植入前胚胎组蛋白乙酰基转移酶GCN5和去乙酰化酶HDAC1表达模式及体外培养对其表达影响[D].浙江大学,2005.