人骨髓基质细胞HS-5的应用

背景^[1-3]

人骨髓基质细胞HS-5是指成体骨髓中的一类多能干细胞。具有分化成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和其他几种结缔组织细胞（如腱细胞）的潜能，亦可转分化成心肌细胞、骨骼肌细胞。

操作流程

1.细胞收到后建议在培养箱稳定4小时左右再依据细胞密度，换液培养或传代。

2.如果细胞为贴壁细胞，而收到时呈悬浮或者部分悬浮的状态，请将悬浮的细胞及时离心，加15%血清的完全培养基到新的培养皿/瓶中继续培养3天；同时原培养瓶中剩下的贴壁细胞更换为15%血清的完全培养基，培养2-3天。若3天后细胞都没有出现增殖而是继续脱落死亡，请及时联系实验室，技术人员会跟进解决。

3.贴壁细胞生长缓慢：适当提高血清浓度（最高不超过20%），或可根据该细胞生长密度，考虑胰酶消化后，转移到新的培养瓶继续培养。

4.生长不均：贴壁细胞若出现生长不均，成岛状生长，可将细胞进行消化，重新打散细胞，加入新鲜培养基进行培养。

培养传代流程

1.吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加1~2 ml 0.25%EDTA的胰酶消化（注意把握消化时间，通常控制在1~2min）。

2.镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁运动时（不建议消化到细胞漂浮）去掉胰酶，加6~8ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散。

3.取出部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，于培养箱中培养。

4.注意培养基PH值变化情况，定期换液，待细胞密度达到70-80%时重复传代操作或者冻存。

应用^[4][5]

用于下调BMP9表达对乳腺癌细胞SK-BR-3与骨髓基质细胞HS-5相互作用的影响及其机制研究

探讨在人乳腺癌细胞SK-BR-3与人骨髓基质细胞HS-5构成的共培养体系中，用RNAi技术介导的BMP9基因下调对SK-BR-3细胞与HS-5细胞相互作用的影响及其可能涉及的靶基因与信号通路，从而为寻求乳腺癌治疗的新靶点和新药物奠定实验基础。

方法：用腺病毒Ad siBMP9感染人乳腺癌细胞SK-BR-3，构建内源性BMP9表达下调的重组细胞SK-BR-3/Ad siBMP9。采用transwell小室将各组SK-BR-3细胞分别与人骨髓基质细胞HS-5间接共培养，实验分三组（空白组：SK-BR-3+HS-5,co-Blank；对照组：SK-BR-3/AdRFP+HS-5,co-RFP；实验组：SK-BR-3/Ad siBMP9+HS-5,co-siBMP9）。

检测共培养体系中两种细胞生物学作用的变化：对各组的SK-BR-3细胞，增殖变化用MTT实验检测；单个细胞集落形成数变化用集落形成实验检测；凋亡变化采用流式细胞术检测；而SK-BR-3细胞和HS-5细胞迁移变化则用划痕愈合实验及无基质胶的transwell实验检测。

下调BMP9表达后，检测共培养体系中两种细胞相关因子mRNA和蛋白水平的变化：RT-PCR检测迁移相关因子（SDF-1，IL-6，MCP-1）变化；Western blot检测SDF-1/CXCR4信号轴变化以及HER2表达和活化状态变化，并检测其下游PI3K/AKT，ERK1/2信号通路的活化状态；加入抗SDF-1中和抗体后transwell迁移实验检测SK-BR-3细胞的迁移变化及Western blot检测HER2活化状态的改变。

将三组共培养3天的SK-BR-3细胞和HS-5细胞按1:1混合后分别注入裸鼠皮下，在裸鼠体内构建乳腺肿瘤微环境模型。

定时观察并记录各组裸鼠皮下瘤生长情况，50天后处死裸鼠，取皮下肿瘤移植物做组织切片。用高倍镜（×400）对切片进行观察，苏木精-伊红染色对肿瘤细胞分化情况进行观察，免疫组织化学染色对肿瘤增殖，迁移相关指标进行观察，TUNEL染色对肿瘤细胞凋亡情况进行检测。

参考文献

[1]The HER2 amplicon includes several genes required for the growth and survival of HER2 positive breast cancer cells[J].Kristine Kleivi Sahlberg,Vesa Hongisto,Henrik Edgren,Rami M?kel?,Kirsi Hellstr?m,Eldri U.Due,Hans Kristian Moen Vollan,Niko Sahlberg,Maija Wolf,Anne-Lise B?rresen-Dale,Merja Per?l?,Olli Kallioniemi.Molecular Oncology.2013(3)

[2]Hypoxia-inducible factor-dependent breast cancer-mesenchymal stem cell bidirectional signaling promotes metastasis[J].Chaturvedi,Pallavi,Gilkes,Daniele M,Wong,Carmen Chak Lui,Kshitiz,Luo,Weibo,Zhang,Huafeng,Wei,Hong,Takano,Naoharu,Schito,Luana,Levchenko,Andre,Semenza,Gregg L.Journal of Clinical Investigation.2013(1)

[3]Molecular mechanisms mediating metastasis of hypoxic breast cancer cells[J].Gregg L.Semenza.Trends in Molecular Medicine.2012(9)

[4]Adenovirus-mediated overexpression of BMP-9 inhibits human osteosarcomacell growth and migration through downregulation of the PI3K/AKT pathway[J].Bo Li,Yuehua Yang,Shengdan Jiang,Binbin Ni,Ke Chen,Leisheng Jiang.International Journal of Oncology.2012(5)

[5]陈莹莹.下调BMP9表达对乳腺癌细胞SK-BR-3与骨髓基质细胞HS-5相互作用的影响及其机制研究[D].重庆医科大学,2014.