戈雷拉肽的合成

背景及概述^[1]

戈雷拉肽又叫N-乙酰基-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-脯氨酸(N-Acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro)，简 写为Ac-S-D-K-P，它是一个氮端乙酰化的内源性四肽，广泛分布于体内各种组织及体液中。这个四肽主要由它的前体物胸腺素β4经由脯氨酰寡肽酶(POP)水解而释放。在血液中的浓度一般为纳摩尔级。戈雷拉肽的药代动力学研究发现，戈雷拉肽静脉注入体内后，很快就被降解，半衰期仅为4～5min。戈雷拉肽在人体内通过两种机制从血浆中清除：①血管紧张素转换酶(ACE)介导的水解作用；② 肾小球滤过作用。其中血管紧张素转换酶(ACE)介导的水解作用是戈雷拉肽代谢的主要途径。

戈雷拉肽是一种多功能性生理调控因子，具有多种生物学活性。早期报道，戈雷拉肽可以通过阻止原始造血干细胞进入S期，使其静止在G0期，而抑制造血干细胞的活性。随后发现戈雷拉肽通过促进血管的生成可以提高表皮的再植能力，加速受损的无血管表皮移植的伤口愈合。戈雷拉肽能够抑制MGM刺激的骨髓 干细胞分化成巨噬细胞，从而起到抗炎作用。近来发现戈雷拉肽对多种细胞的增殖具有抑制作用。

戈雷拉肽是一种重要的抗多种器官纤维化的因子。戈雷拉肽能抑制胶原 等细胞外基质的合成。研究发现戈雷拉肽对PDGF介导的心脏成纤维细胞增殖和 胶原合成均有抑制作用；进一步实验表明，戈雷拉肽可能通过抑制血清中诸多因 子或活性成分而发挥其抑制血清诱导刺激的心脏成纤维细胞增殖和胶原合成及表达 的作用，这可能与抗心脏纤维化的作用有关。除心脏纤维化以外，目前的研究在戈雷拉肽对肾脏、肝脏、肺脏等器官纤维化方面，都能发挥一定的抗器官纤维化的活性。

制备^[1]

1.肽树脂的合成

(1)制备Fmoc-Pro-树脂：

称取5克2-氯-三苯氯甲基树脂，用二氯甲烷(DCM)100ml浸泡60分钟，在上述的树脂中，加入DIEA 4.5ml，3.38g Fmoc-Pro-OH，25℃反应2小时，再加入封闭试剂甲醇1.5ml，25℃反应2小时，树脂用35ml异丙醇洗涤两次、再用35ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗两次，获得Fmoc-Pro-树脂；

(2)制备Fmoc-Lys(Boc)-OH树脂：

在步骤(1)的Fmoc-Pro-树脂中，加入35ml脱帽试剂，25℃反应10分钟，用真空泵抽干，重新加入35ml脱帽试剂25℃反应30分钟，抽干，用35ml异丙醇洗涤2 次，35mlDMF洗涤2次，重蒸馏的35mlDMF洗涤2次，取少量树脂加4ml茚三酮试剂， 沸水中加热3min，检测结果呈阳性。加入用重蒸馏的DMF溶解的4.69gFmoc-Lys(Boc) -OH、2mlDIEA、3.22gTBTU、5mlHOBt的混合物，22℃反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次，DMF洗涤2次，抽干，取少量树脂加4ml茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴性。获得Fmoc-Lys(Boc)-Pro-树脂；

所述的脱帽试剂的组分和体积比为：PIP∶DMF＝1∶2.5，下同；

(3)制备Fmoc-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂：

在步骤(2)的Fmoc-Lys(Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件 同步骤(2)；加入用重蒸馏的DMF溶解的4.12g Fmoc-D-Asp(otBu)-OH、2mlDIEA、3.22gTBTU、5mlHOBt的混合物，22℃反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2 次，DMF洗涤2次，取少量树脂加4ml茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴 性，抽干，取少量树脂加4ml茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测结果呈阴性。获 得Fmoc-D-Asp(otBu)--Lys(Boc)-Pro-树脂；

其余操作以及工艺条件同上；

(4)制备Fmoc-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂：

在步骤(3)的Fmoc-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件同步骤(2)；加入用重蒸馏的DMF溶解的3.84g Fmoc-Ser(tBu)-OH、2mlDIEA、 3.22gTBTU、2mlHOBt的混合物，22℃反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2 次，DMF洗涤2次，抽干，取少量树脂加4ml茚三酮试剂，沸水中加热3min，检测 结果呈阴性，获得Fmoc-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂；

(5)制备Ac-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)--Lys(Boc)-Pro-树脂(肽的乙酰化)：

在步骤(4)的Fmoc-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂中，加入脱帽试剂脱帽两次，条件同步骤(2)；加入6ml乙酸酐、50mlDCM、3mlDIEA的混合物，22℃反应60分钟，用真空泵抽干，用异丙醇洗涤2次、DMF洗涤2次，甲醇洗3次，甲醇浸泡30-60分钟，抽干，用氮气吹干肽树脂成干颗粒，所得到的肽树脂为获得Ac-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂；

2.肽树脂的切割分离

把吹干的Ac-Ser(tBu)-D-Asp(otBu)-Lys(Boc)-Pro-树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至-20℃的切肽试剂(TFA∶H2O＝95∶5，体积比)80ml，20℃反应1.5小时，过滤除去树脂，加-20℃的冰乙醚沉淀，离心收集沉淀物，用冷乙醚洗涤1次，低温冷冻干燥16小时，获得四肽异构体粗品2.1g；

3.对四肽异构体粗品的分离纯化

(1)样品准备：将四肽异构体粗品溶于水溶液中，过滤，备用。

(2)四肽异构体粗品HPLC分析：取滤液20μl用HPLC分析，色谱条件：C18色谱柱 (Hypersil-ODS2，Φ5um 4.6×250mm)，流动相：A：0.1％三氟乙酸加99.9％水；B： 0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈；梯度洗脱；流速为1ml/min；检测波长为：215nm；

(3)四肽异构体粗品HPLC纯化：

取滤液3ml用HPLC纯化，选用C18色谱柱(Hypersil-ODS2，Φ5um 10×250mm)， 流动相：A：0.1％三氟乙酸加99.9％水；B：0.1％三氟乙酸加99.9％乙腈；梯度洗脱； 流速为10ml/min；检测波长为：215nm；收集目标峰液，样品峰合并后去盐，冻干， 获得四肽异构体纯品1.56g。

(4)四肽异构体纯品分析：

取少量样品，配成0.5mg/ml，过滤，取20μl用HPLC分析，条件同四肽异构体 粗品HPLC分析条件。

本实施例中，戈雷拉肽粗品的纯度为91.8670％，收率为 74.3％，纯度为98％(HPLC归一化法)。

参考文献

[1] [中国发明,中国发明授权] CN201110436671.9 一种利用固相多肽合成法合成四肽异构体的方法及其应用