化学发光试剂：辣根过氧化酶、ECL、鲁米诺?和增强发光酶反应原理介绍

化学发光试剂辣根过氧化酶

辣根过氧化酶使试剂中的发光物（luminol）氧化并发光，而试剂中含有增强剂这使得发光增强了1000倍。在免疫印迹中，将复杂的蛋白混合物经sds-page分离，并转移到固相膜上（如nc、pvdf）等，用于免疫学检测，经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接（标记一抗）或间接（标记二抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，luminol发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此光可经x光胶片(放射自显影片)感光记录下来。

用途：非放射性发光系统，用于检测固定在膜上的蛋白，其敏感性达1-5pg。用x光片可快速地获得永久的硬拷贝结果。所含独特的底物足以维持12小时以上的发光，便于反复曝光操作，免疫印迹膜经抗体脱卸处理后可供再次抗体探查使用。适用于痕量蛋白或核酸检测。

使用方法

1. 印迹膜制备 按常规方法完成SDS-PAGE和电转膜操作，适当的封闭非常重要。可以通过标记一抗或二抗的手段引入HRP，一般采用市售的HRP二抗交联物。仔细地淋洗对于降低背景非常重要，在与HRP交联物温育后，膜片更需仔细洗涤，所有步骤均在室温下完成。

2. 化学发光试剂的配置 在使用前等量混合a液和b液，混合后尽快使用。将膜片置混合液中于室温下振荡温育2分钟，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆盖全膜片。

3.蛋白信号显现

1). 用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸以吸去过量试剂。

2). 置膜片于二层保鲜膜之间，小心赶尽气泡。

3). 将膜片吸附蛋白面朝上，置于x光片盒中。

4). 于暗室中压上x光片。

5).根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达效果。显影冲洗。

6). 调节曝光时间，再次曝光显影。

4、膜的重复使用：

配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巯基乙醇的溶液，膜放入后，70?c振荡水浴30分钟。再用tbst或pbst缓冲液洗脱，最后用bsa（牛血清白蛋白）或牛奶封闭。

操作注意：

1. 试剂每个批号均独立优化，请不要混用或稀释试剂以免降低敏感性；

2. 加入一抗后膜不能再干燥；

3. 适当地封闭和洗涤膜片至关重要；

4. 使用前配置化学发光试剂，配置足够覆盖膜片即可，弃去使用过的混合试剂；

5. 使用干净取样头取用每种试剂；

6. 张片子建议曝光1分钟，观察结果后判断曝光时间可从30秒至2小时不等；

7. 除了放射自显影片曝光和洗片处理外，所有步骤均不必在暗室中操作；

8. 膜片可经适当方法洗脱原有抗体，再次印迹使用，在此情况下，此试剂更为理想；

9. 因为它不象生色物质需要从膜片上清除底物。

10. nan3能抑制HRP活性，应避免使用nan3。

安全性：无特殊毒性，按普通化学品处理。如果不慎与眼、皮肤和衣物接触，请立刻用大量清水冲洗。

储存：2-8℃密封避光保存一年。

化学发光试剂ECL

ECL在化学领域，是一种化学发光试剂。electrochemiluminescence

化学发光试剂，一般是WesternBlot的最后一步，加入1：1的溶液A和溶液B，覆盖pvdf膜，可以显色来观察实验结果。

原理：一般使用的发光液A和B分别是鲁米诺和过氧化氢，在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下，鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。

在发光过程中不需要消耗HRP,HRP只是起催化作用，所以只要HRP没降解失活，是可以重复加发光液的。但HRP作为一种蛋白酶，在室温放置时间过长，是会降解的；同时在发光过程中有什么物质（比如显影液）污染了膜的话,也有可能灭活膜上的HRP。

化学发光试剂鲁米诺

HRP 标记的CLEIA常用的底物为鲁米诺(32氨基邻苯二甲酰肼,lum ino l) ,或其衍生物如异鲁米诺(42氨基邻苯二甲酰肼) , 是一类重要的发光试剂。其结构如图4 所示。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行,在过氧化物酶及活性氧[ 过氧化阴离子(O 2- ) , 单线态氧(1O 2 ) , 羟自由基(OH·) , 过氧化氢(H2O 2)]存在下,生成激发态中间体, 当其回到基态时发光, 其波长为425nm。

早期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体) ,但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体, 进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物, 在过氧化物酶和起动发光试剂(NaOH2H2O 2) 作用下, 鲁米诺发光, 发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。Kodak Am erliteTM半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的。

化学发光试剂增强发光酶

增强发光酶免疫分析(enhanced luminescence enzyme immunoassay, ELEIA )在发光系统中加入增强发光剂, 如对2碘苯酚等, 以增强发光信号,并在较长时间内保持稳定, 便于重复测量, 从而提高分析灵敏度和准确性。在全自动分析仪上, 还可通过计算机严密控制, 进行自动操作, 如加试剂,混合, 温育, 洗涤, 加发光试剂, 发光计数, 数据处理, 绘制标准曲线, 直至完成病人血清样品的分析并打印出结果。Am erliteTM发光增强酶免分析系统用荧光素、噻唑等增强剂, 其发光时间可持续长达20m in, 试剂盒有甲状腺功能检测的促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素, 与性激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮, 以及其他方面的如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。

ALP标记的CLEIA所用底物为环1, 22二氧乙烷衍生物, 这是一类很有前途的发光底物 ,用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团——金刚烷基, 其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团,在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。最常使用的底物是AM PPD [ 32(2’2 spiroadam an2tane ) 42methoxy242( 3’2 phosphoryloxy) 2phenyl21,22dioxetane ], 中文名为: 32(2’2螺金刚烷) 242甲氧基242(3’2 磷酰氧基) 2苯基21, 22环二氧乙烷)。在碱性磷酸酶(AL P) 作用下,磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基, 得到一个中等稳定的中间体AM PD (半寿期为2～ 30m in) ,此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子, 当其回到基态时产生470nm 的光,可持续几十分钟。AM PPD 为磷酸酯酶的直接化学发光底物,可用来检测碱性磷酸酯酶或酶和抗体、核酸探针及其它配基的结合物。可检测到碱性磷酸酯酶的浓度为10- 15mol/L 。