深度长文讲述抗HIV药物恩曲他滨的发现之旅

前言

1981年6月5日美国CDC (Centers for Disease Control and Prevenition，疾病控制与预防中心)的MMWR (Morbidity and Mortality Weekly Report，发病率和死亡率周报)次公开了AIDS流行病：五名男同性恋被发现严重的免疫缺陷。三周后MMWR报导，在纽约和加州有26个男同性恋发现患卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)。1982年CDC引进了AIDS这个术语，并确定了患AIDS的风险。1984年AIDS的病原体确定为一种新的逆转录病毒，后来被命名为HIV。至1991年底，有51个国家发现HIV感染，WHO报导超过1千万人被感染。同年CDC报导有在美国超过1百万人感染HIV。至2015年底全球有3670万HIV感染患者。

在HIV流行早期(1984年)，时任美国卫生与人类服务部(HHS)部长Margaret  Heckler就提出希望在2年内完成AIDS疫苗的测试。不幸的是，期望中的疫苗并没有出现，而寻求有效的抗病毒药成为唯一选择。由于缺乏经验，当时仅发现用于治疗疱疹病毒感染的阿昔洛韦，其他制药公司很少涉及抗病毒药的研发。BW (Burroughs Wellcome，Wellcome PLC的附属子公司)开发了阿昔洛韦，并把HIV/AIDS作为其正在进行的抗病毒项目的延伸。1984年底，BW研究人员发现，作为一种失败的抗癌药AZT(齐多夫定，1)，对替代的逆转录病毒具有活性，他们将化合物提交给美国国家癌症研究所(NCI)确定其抗HIV的活性。1985年2月NCI确认AZT具有抗HIV活性，BW公司立即向FDA提交IND。仅基于一个临床试验结果，1987年3月9月FDA就批准AZT上市。尽管在批准初期，围绕着AZT剂量和临床有效性存在大量的争议，随之对早期HIV患者进行的系列试验增强其有效性。然而，AZT却因为其毒性和出现抗病菌株而走向末路。在BW公司内部，他们觉得可能在6个月内将有其他抗病毒药获得批准以替代AZT，是以开始采取比较激进的方式确定具有更好安全性和耐药性的核苷衍生物。

而在外界，抗HIV的研发开始呈现竞争势头。1991年12月，地达诺新(DDI，2)批准上市。1992年6月，扎西他滨(DDC，3)批准上市，但是该药的使用因其严重的神经系统毒性所限。在1994年之前，AZT、DDI和DDC是治疗HIV/AIDS的唯一选择。

FTC的发现之旅

1989年埃默里大学(Emory University)的Raymond Schinazi博士参加了第15届AIDS国际研讨会，会后带给了Liotta博士一张描述BCH-189 (4)合成的海报，从此埃默里大学正式开展关于3-杂核苷抗病毒药的研究。这份海报描述了BCH-189的合成，同时显示其具有较好的抗HIV活性，并且无明显的细胞毒性。但该报导BCH-189的合成收率非常低，并因此产生研究其构效关系(SAR)的一个主要障碍，其最主要的问题步骤是立体糖基化反应，产生α与β非对映体1:1的混合物。

因其仅β-异构体能作为NRTIs，Liotta团队开发出一个通用的β-选择性糖基化方法。先与SnCl4反应，使氧硫环戊烷环选择性络合，以减少1,2-位与羟甲基的交叉反应。这种络合反应强烈的阻止了α-面的甲烷硅基化。为了评估这种络合反应策略的可行性，Liotta团队从羟乙醛11制备了化合物13。与假说一致，化合物13的Vorbruggen糖基化反应产生了不能分离的N-糖基化正位异构体混合物。然而使用SnCl4在常温下就可产生β-胞嘧啶化合物14。HPLC检测其选择性为β:α>300:1，可以预测该策略为合成2-脱氧核苷衍生物中3-杂核苷立体化学的糖基化提供了一种通用的方法。

根据上述反应路线，Liotta团队制备出了具有抗HIV活性的化合物4，并由Schinazi实验室对该化合物外周血单个细胞核(PBMCs)感染进行确认。由于Liotta与BW公司的Painter以及该公司一直进行的激进的NRTI计划有长期的合作关系，Liotta将该化合物寄给Painter和进一步证实其活性和无毒性的Furman。另外耶鲁大学的Yung-Chi Cheng博士确认4可以潜在地抑制乙肝病毒复制。总之，这些发现促使研发4作为一种抗HIV药是件非常令人兴奋的举措，制备立体异构体4并确定是否比消旋体具有更优的活性和少毒性就变得非常紧迫。

之后，分解对映体4就变成一项高度竞争性的事情。Liotta以及其他团队共同努力，开发出许多方法获得这些立体异构体，或通过立体选择合成，或通过手性解析途径。在所有公开出版的报告中，4的立体异构体的抗HIV活性基本均等。但其(-)-4比(+)-4毒性更少，随后(-)-4被命名为3TC(拉米夫定，Lamivudine)。令人惊喜的是，(-)-4拥有“非自然”和“L-核苷”的绝对构型。曾经一段时期许多研究人员都期望L-核苷比它们“自然”的D-相对物可能拥有更好的安全性。假定这些非自然的L-类似物在寄主(人类)转录过程中将不介入内在的核苷或核苷酸，因为它们将不再与寄主的聚合酶联结，同样也将不会与HIV编码逆转录酶联结。不幸的是，这个假定告吹，这儿没有灵丹妙药！90年代早期，3TC的研发是Glaxo和Biochem制药共同完成的。

在3TC的研发故事从一个非常有趣的发现到快速推进至跨国临床计划的这个时期，Liotta团队正准备制备一系列5-取代的嘧啶氧硫环戊烷核苷类似物并评估其抗HIV性能。除了一个化合物外，这些取代物都被证明无活性。5-F取代物，随后被命名为FTC，展现出了与3TC一样好的抗HIV活性/毒性性能。随后Painter和Furman确定了FTC与3TC一样，可潜在的抑制HBV病毒复制。基于这些初步的结论，埃默里大学(Liotta /Schinazi)和BW公司(Painter /Furman)达成科研合作，致力于研发FTC用于治疗HIV和HBV。在18个月内这个科研合作达成一个许可协议：BW公司将研发该化合物(研发代号524W91)，用于治疗HIV和HBV的病毒感染。

BW团队非常急切开启了FTC研发之旅，在吹嘘其合成路线的优点之后，就要求Liotta团队制备200g消旋体FTC，用于开始生成数据以供公司内部评估其项目状态。获得这个状态将会触发完成所有提交IND所需文档的物力和财力的有效性，若FDA同意所提供的数据，将时间开启临床I期试验。由Liotta团队快速制备FTC，BW团队则开展严格的药效和药代评估。实验证实该化合物非常有效，拥有良好的口服生物利用度，更重要的是还拥有一个非常纯净的毒性性能。如BW团队无根据的描述：FTC将被胞苷(或脱氧胞苷)脱氨酶脱去氨基，随后糖基化产生细胞毒素剂5-FU。

接下来的研究是如何获得多克级数量的FTC对映体。埃默里团队大多数人专注于或立体选择合成对映体，或动力解析途径，而Liotta团队更倾向于前者，因为他们使用消旋合成法从内酯中得到富含对映体。但是，当他们尝试合成的时候，仅仅生成了消旋体FTC，追溯其外消旋作用的原因是显而易见的。SnCl4的络合增强了S原子的核仁分离，因而允许一个立体无规的C-S键比分子间糖基化更快速的打开和重合。

实验证明动力解析途径更成功，在测试一系列蛋白水解酶和5-烷基酯的组合物后，Liotta团队获得了一条高效途径：在pH8的缓冲乙腈中，用猪肝酯酶可以高效对映选择性水解消旋FTC丁酸酯。

一旦转换率达到50%，水解反应就显著变慢。通过CHCl3萃取，使用丁酸酯有助于从中间体中分离出未反应物质。将该方法应用于生产多克级数量的对映体纯(-)-FTC时，证实非常有效。令人惊喜的是，两个FTC对映体都没有展现出任何细胞毒性。随后临床前研究以一种轻快的步伐进行中，直到BW惊人的发现，在HIV片段研究过程中，(-)-FTC被一个单体抗突变体M184V快速选择，与野生型病毒相比，其敏感性少500-1000倍。Painter以其永生难忘的问候电话通知Dennis Liotta：“Dennis，FTC is dead！”那一刻，似乎看到埃默里和BW团队多年的努力化为灰烬。

幸运的是，乌云背后仍有一丝幸福线。两个独立研究小组同时进行体外试验，评估氧硫环戊烷核苷类似物3TC和FTC与其他NRTIs组合的影响。Mathes等人将已经和未经AZT治疗的病人中分离的细胞，放入淋巴细胞培养基系统中用3TC/AZT和FTC/AZT组合物进行测试。加入3TC或FTC之后的AZT对耐药突变的病毒具有协同和活性。Tisdale等人证实AZT/FTC组合物可以显著延缓野生型病毒的耐药病毒的出现。基于这些数据，这些作者建议用AZT与一种氧硫环戊烷核苷类似物组合治疗HIV/AIDS。随后4个独立的临床试验证实AZT-3TC组合对已经和未经AZT治疗的病人有效。1997年9月26日FDA批准一个复方组合物Combivir (AZT300mg+3TC150mg)上市，用于治疗HIV感染。

1995年9月，BW公司向FDA提交关于524W91 ((-)-FTC)的IND，10月开启临床I期试验。试验在18名CD4值>200的HIV感染者中进行。HIV阳性志愿者随机接受了6个从200-1200mg单独递增的524W91或安慰剂的口服剂量(200/ 400/ 600/ 800/ 1000/ 1200mg)，每种剂量都至少间隔6天服用。通过对比一种剂量与高脂肪膳食联用而另一剂量处于禁食状态，观察食物中药代的影响。在这些试验中，没有观察到524W91的副作用，其药代动力学因小的个体差异呈线状，由此开启了临床II期试验。

1995年1月23日Glaxo PLC公司拟以$140亿收购Wellome PLC公司，当两个公司完成合并时，在制药和医疗卫生部门的合并成为当时前三大交易。Wellcom公司23亿欧元的销售额对Glaxo公司57亿欧元来说是一个非常引人注目的加成，合并后其销售额达83亿欧元。合并后股东发生变化，同时通过减少7105个工作岗位来降低生产成本，其中包括1953个研发(R&D)岗位。这个收购是多层面的，其中最引人注目的部分包括收购产品和专利权以确保GlaxoWellcome成为世界领先的抗病毒公司。由于Glaxo PLC正在开发另一氧硫环戊烷核苷类似物3TC，两公司合并提供了一个阻碍竞争性产品(-)-FTC研发机会 ，FTC研发自此中断。

1996年，作为BW公司HIV核心研发团队，以David Barry博士为首的研发团队离开了GloxaWellcome公司，并成立一个新的生物技术公司--三角制药(Triangle Pharmaceuticals Inc.)。三角制药策略的一个关键就是许可并快速重启FTC研发。当GloxaWellcome放弃FTC研发时将研发和权益归还给埃默里大学，至1996年4月底，三角制药获得FTC研发和商业化的许可。但是，其GloxaWellcome的数据(在合并前由BW公司产生的数据)、药品、专利权都需要跳跃式启动项目。为了推动临床研发，三角制药在1997年8月提交一份新的IND，并快速开始一系列I/II期临床研究，同时用剂量对HIV和HBV进行关键药效试验。这些研究结果进一步支持药品的安全性和耐受性，同时确定治疗HIV感染的剂量为200mg/天。在为期10天的II期研究中，80名HIV患者被随机分配到四种剂量之一(25/ 100/ 150/ 200mg)，每日一次。200mg/天的剂量显示了出众的病毒抑制，其HIV-1血浆的整体减少比服用150mg/2次/天的3TC效果还好。基于这些结果，200mg/天的剂量进入了III期HIV关键临床试验。在HBV患者中大量的研究中确认，在之后的HBV研究中将200mg/天的剂量作为剂量。1998年8月，FTC被授予“快速通道”。

80年代治疗HIV为单一疗法，1996年美籍华裔科学家何大一提出HAART，是通过三种或三种以上的抗病毒药物联合使用来治疗HIV的疗法，也称为鸡尾酒疗法。HAART极大的减少了与HIV感染和AIDS相关的发病率和死亡率。在HAART成为标准疗法同时，FTC进入III期，其关键药效试验采用FTC与其他两种已批准的抗病毒药组合。最终，基于48周的临床试验(FTC-301 & FTC-303)的积极数据，FDA批准了FTC。这两个试验，都达到主要终点：血浆中病毒的减少，表现为免疫功能的CD+4细胞数值的增加。

这两个III期临床结果都为正面，即两个研究都达到主要终点，在三种药品组合中，当与每日两次的司他夫定(d4T)和3TC直接对比时，FTC被证实具有同等或更优的抗HIV活性。在FTC-301试验中，FTC/地达诺新/依发韦仑组合物对比司他夫定/地达诺新/依发韦仑组合物，该试验招募了571名抗逆转录病毒未经治疗的患者。经过48周的治疗，以达到病毒载量低于50 copies/ml为标准，接受FTC治疗的患者中有78%，而接收司他夫定治疗的患者为59%；另外CD4+细胞响应值，FTC受体增加了168 cells/ μL，司他夫定受体增加了134 cells/ μL。而FTC-303试验则是以一天两次的3TC和一天一次的FTC在相同的背景下对比安全性和有效性。研究表明，患者从一天两次成功转换成一天一次的药物治疗方案。基于上述数据，2002年9月三角制药向FDA提交NDA申请。

第三个临床III期试验FTC-302，于1999年8月在南非共和国开展，该试验为支持批准FTC用于治疗HIV感染，担当了第二关键研究的重任。该试验为随机双盲试验，为期48周治疗，以200mg/天的FTC和150mg/2次/天的3TC进行疗效对比。这两种药都与司他夫定组合，一组与奈韦拉平组合治疗基线病毒载量<100000 copies/ml的患者，另一组与依发韦仑组合治疗基线病毒载量>100000 copies/ml的患者。2000年4月，三角制药收到一封来自南非药品控制委员会(MCC)的信：由于出现许多与肝脏相关的严重副作用事件包括两名妇女死于肝炎，MCC要求三角制药终止FTC-302试验。同月，FDA发布关于FTC的临床试验暂停(Clinical Hold)。试验中断后，研究发现大量发生与肝脏相关的副作用事件都发生在包含奈韦拉平的药物治疗方案的患者身上。两名死亡的患者(一名随机接受FTC，另一名随机接受3TC)都同时接受奈韦拉平的治疗。基于数据分析得出结论：发生肝脏毒性归因于奈韦拉平。最终，MCC与三角制药达成一致，完成FTC-302试验，随后根据MCC认可书，三角制药请求FDA取消临床试验暂停。然而，请求书被拒，而从试验得到的数据虽然强烈的支持了FTC的药效，仍不能被用于批准。

当FTC临床研究持续进行时，一个研发的关键阻碍出现了。1996年7月23日，埃默里大学关于氧硫环戊烷核苷个专利公开的日子，埃默里大学起诉GlaxoWellcome和Biochem公司专利侵权，声明了3TC的所有权，同时提平行诉讼，声明了FTC的所有权。两被告反诉，在美国佐治亚州北部地区法院和美国专利商标局(USPTO)开始了一系列复杂的诉讼，直至六年后才完全结束诉讼。正如1996年8月在亚特兰大商业纪事中提及这些诉讼：“在争论中隐现的问题是：埃默里大学是否在寻求禁令以停止销售3TC。”基于对HIV感染患者伦理考量，埃默里没有寻求禁令，甚至愿意更快速解决关于知识产权的争论纠纷。

1999年5月7日，当GlaxoWellcome公司将FTC全球范围内排他性授权许可给埃默里大学和三角制药，包括FTC研发和临床数据，药品，专利权，部分的争论解决了。同时在FTC诉讼中埃默里与GlaxoWellcome达成一致，共同豁免专利权益。2002年6月6日，GSK (GlaxoSmithKline)、Shire和埃默里大学声明达成一个全球协议，解决了与3TC和FTC相关的所有专利争议：埃默里大学获得Shire的现金和关于FTC的专利许可；Shire和GSK公司获得埃默里大学关于的3TC专利许可。随着围绕FTC相关的专利争议的解决，FTC的临床研发终于可以毫无疑问地完成。

与此同时，制药和生物技术部门的合并持续影响着FTC的研发。2002年12月4日，吉利德科学(Gilead Sciences，NASDAQ：GILD)声明已签署协议：他们将收购三角制药。2003年1月23日收购完成，此次交易额约为4.64亿美元。除了买下三角药制药，Gilead公司还支付给埃默里大学5.4亿美元，作为支付买断FTC未来销售提成收益的权利，埃默里拿出其中的2亿美元作为奖励金给Schinazi、Liotta和另一合作开发者Woo-BaegChoi。在收购三角制药之前，吉利德已上市两款抗病毒感染新药：用于治疗HIV感染的Viread(替诺福韦)和治疗HBV的Hepsera(阿德福韦酯)。而三角制药在研药尤其是FTC，提供了增效和增值的机会。

结论

吉利德全面接管FTC的研发，并于2003年7月2日获得FDA批准上市，商品名：Emtriva，剂量：200mg，每日一次。一年之后，2004年8月2日FDA批准每日一次的Truvada (FTC200mg + Viread300mg)上市，并快速成为治疗HIV感染的一线治疗药，直至2006年7月12日FDA批准每日一次的Atripla (FTC200mg+Viread300mg+依发韦仑600mg)上市，HIV治疗的游戏规则才发生改变。对从一开始就介入HIV治疗研发的人来说，Atripla成为游戏规则改变者：二十几年的研究将AIDS从“死刑”变成可控的慢性疾病。

谨以此文向一直致力于药物研发的坚守者们致敬！

此原创文章转自： 言午 药渡