16HBE细胞专用培养基的培养操作方法

背景及概述^[1]

16HBE细胞又称人支气管上皮样细胞，人支气管上皮细胞主要功能：(1)支气管表面的上皮细胞构成了基底柱状结构，清除粘液纤毛。(2)由纤毛、无纤毛和能分泌黏液的细胞等混合细胞群组成物理屏障，可有效防止多种有毒物质。(3)产生和分泌大量化学介质和细胞因子形成高度复杂的宿主防御系统。16HBE细胞专用培养基主要用于人支气管上皮样细胞的培养。

培养操作^[1]

1.复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL16HBE细胞专用培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2.细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1）弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2）加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3）按6-8ml/瓶补加16HBE细胞专用培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4）将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml16HBE细胞专用培养基的新皿中或者瓶中。

3.细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1）细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2）4min1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10⁶/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3）将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

参考文献

[1]16HBE细胞专用培养基说明书