虎红琼脂的应用

背景^[1-3]

虎红（孟加拉红）琼脂可用于霉菌和酵母的计数、分离和培养，配方（g/L) 蛋白胨5g；葡萄糖10g；磷酸二氢钾1g；硫酸镁0.5g；琼脂15g；孟加拉红0.03g；氯霉素0.1g；最终pH 7.2±0.2。

原理：蛋白胨提供碳源和氮源;葡萄糖提供能源;磷酸二氢钾为缓冲剂;硫酸镁提供必须的微量元素;琼脂是培养基的凝固剂;氯霉素可抑制细菌的生长;孟加拉红作为选择性抑菌剂可抑制细菌的生长，并可减缓某些霉菌因生长过快而导致菌落漫延生长。

用法：1、称取孟加拉红(虎红）琼脂31.6g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌20min。

2、无菌操作称取检样25克(或25mL)，放入含有225mL灭菌水的玻璃三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液，依次做1：100、1：1000……稀释。

3、根据对样品污染情况的估计，选择2—3个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿。

4、将凉至45℃左右的培养基注入平皿中，待琼脂凝固后，倒置于25—28℃温箱中培养。

5、3d后开始观察结果，共培养观察5d。

6、计算方法：通常选择菌落数在10—150之间的平皿进行计数(如食品卫生国家标准)，也有选用5—50个之间的平皿进行计数(化妆品卫生规范)，同稀释度的2个平皿菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克(或每mL)检样中所含霉菌和酵母菌数。

应用^[4][5]

用于烟支霉变微生物的分离与霉变成因研究

以标准GB4789.15食品中霉菌和酵母菌检验计数为基础，对烟叶及烟支中微生物的检测方法进行了探索，建立了适合烟草/烟支微生物分离计数的检测方法。

方法包括：以均质器拍打处理烟叶样品，采用PCA、PDA、孟加拉红、高盐察氏、DG18五种培养基分离微生物，培养真菌温度为28℃，培养细菌温度为36℃，微生物计数方法为平板计数法。

通过对5种品牌烟支进行人工促霉研究发现，在贮存6个月时，YD、TY、CY烟支未包装样品都出现霉变现象，且样品中嗜干霉菌数量显著高于同期其他样品，而JQ、BL烟支在贮存期内微生物数量无显著增加。研究对比了正常烟支与霉变烟支微生物的种群和数量，利用或然事件研究方法确定了5种烟支致霉菌，分别编号为A1、A2、A3、A4、A5。通过单菌落形态观察及显微镜孢子和菌丝观察，初步鉴定得到A1为枝孢霉属霉菌，A2为曲霉属黄曲霉菌，A4为青霉属桔青霉菌，A3、A5未能鉴定种属。

通过烟支霉变影响因素的分析研究发现，当烟丝含水率超过13%时，烟丝中霉菌含量显著增加，发生霉变的风险增大；当成品烟支包装密封度低于60mmH2O时，随着放置时间的延长，样品中微生物数量显著增加；当成品烟支样品在温度28℃、湿度为80%环境下存放时，会引起霉菌的显著增加，但在温度和湿度相对较低的环境下，微生物数量不会显著增加；成品烟支不同包装方式可能引起细菌和酵母菌数量的差异，但对霉菌的数量无明显影响。

对成品烟支3个关键生产工序前后微生物数量对比发现，料液的加入会导致微生物数量的增加，且随着储存时间延长，可能引起烟叶的霉变，而其他2个工序前后微生物数量无较大差异。

参考文献

[1] Biocontrol of postharvest diseases on sweet cherries by four antagonistic yeasts in different storage conditions[J].Guozheng Qin,Shiping Tian,Yong Xu.Postharvest Biology and Technology.2003(1)

[2] Microbiology of the Fermentation of Spanish Tobacco.Tamayo A I,Cancho F G.International Congress of Microbiology.1953

[3] PCR protocols:a guide to methods and applications.Innis MA et al.San Diego:Academic press.1990

[4] Moulds.David Malloch.University of Toronto Press.1984

[5]谢欣.烟支霉变微生物的分离与霉变成因研究[D].华南理工大学,2014.