大鼠甲硫氨酸亚砜还原酶B1(MSRB1)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠甲硫氨酸亚砜还原酶B1(MSRB1)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠甲硫氨酸亚砜还原酶B1(MSRB1)水平。用纯化的大鼠甲硫氨酸亚砜还原酶B1(MSRB1)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入大鼠甲硫氨酸亚砜还原酶B1(MSRB1)，再与HRP标记的大鼠甲硫氨酸亚砜还原酶B1(MSRB1)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠甲硫氨酸亚砜还原酶B1(MSRB1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠甲硫氨酸亚砜还原酶B1(MSRB1)浓度。

检测原理：

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。

此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

应用^[4][5]

用于巨噬细胞MsrA对动脉粥样硬化的干预研究

甲硫氨酸亚砜还原酶A(MsrA)能特异性地还原Met氧化产物——甲硫氨酸亚砜(MetSO),是一类进化保守、普遍存在的细胞内抗氧化酶。

方法：构建含hMsrA的pWPI重组慢病毒载体,以含绿色荧光蛋白GFP的空载体为对照,分别与包装质粒A8.91和包膜质粒pD2G共转染293t细胞系,包装病毒颗粒,高速离心浓缩后检测病毒滴度。体外实验：将慢病毒颗粒以适宜的MOI(Multiplicity of infection)感染小鼠原代腹腔巨噬细胞和传代RAW264.7巨噬细胞系,观察高表达hMsrA对oxLDL刺激下巨噬细胞生物学功能的影响。

采用油红O染色评价细胞泡沫化状态：荧光探针DCF检测细胞ROS水平；ELISA法检测炎症因子TNF-α、IL-6的分泌；RT-PCR和Western Blotting方法检测脂质转运相关蛋白ABCA1、ABCG1、SRBI和LXR的转录和表达水平。

体内实验：慢病毒载体体外感染小鼠骨髓造血干细胞(HPCs),通过骨髓移植技术将其回输到apoE-/-受体鼠中,小鼠高脂饮食12周后安乐死,检测小鼠血浆脂质含量(TC、TG)、炎症水平(TNF-α、IL-6、MCP-1)、抗氧化酶活性(PON1、SOD)及HPCs和脾脏中hMsrA表达水平。并通过对小鼠主动脉窦的冰冻切片及油红O染色,胸腹主动脉段en face剖面分析,评价hMsrA对动脉粥样斑块的影响。结果：成功构建慢病毒颗粒LV-hMsrA,基因测序及蛋白印迹法分别证实了目的蛋白hMsrA的碱基序列和蛋白表达均没有发生突变。

氧化应激条件下,巨噬细胞高表达hMsrA可以显著降低细胞内的脂质沉积和ROS水平,抑制细胞炎症因子IL-6和TNF-a的分泌(P<0.05)。与LV-GFP组细胞相比,LV-hMsrA组细胞的脂质转运相关蛋白ABCG1、LXR、ABCA1和SRBI的mRNA和蛋白水平都有显著提高(P<0.05)。而无刺激培养下,细胞内高表达hMsrA对ABCA1、ABCG1、SRBI和LXR均没有影响(P>0.05)。

参考文献

[1]ApoE-dependent sterol efflux from macrophages is modulated by scavenger receptor class B type I expression.Huang Zhi Hua,Mazzone Theodore.Journal of Lipid Research.2002

[2]Differing association of macrophage subsets with atherosclerotic plaque stability.Medbury HJ,James V,Ngo J,Hitos K,Wang Y,Harris DC,Fletcher JP.International Journal of Angiology.2013

[3]Accuracy and Biological Variation of Human Serum Paraoxonase 1 Activity and Polymorphism(Q192R)by Kinetic Enzyme Assay.Richard W.Browne,Stephen T.Koury,Susan Marion,Gregory Wilding,Paola Muti,Maurizio Trevis.Clinical Chemistry.2007

[4]Tumor-specific dendritic cells generated by genetic redirection of Toll-like receptor signaling against the tumor-associated antigen,erbB2.Y Xu,P K Darcy,M H Kershaw.Cancer Gene Therapy.2007

[5]周赤燕.巨噬细胞MsrA对动脉粥样硬化的干预研究[D].武汉大学,2013.