大鼠凋亡诱导因子(AIF)ELISA 试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠凋亡诱导因子(AIF)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠凋亡诱导因子（AIF）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠凋亡诱导因子（AIF）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

凋亡诱导因子是一类存在于线粒体内外膜间隙的保守的黄素蛋白。具有双重功能，在细胞正常的生理状态下，作为线粒体氧化还原酶，能催化细胞色素c和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）之间的电子传递；当细胞受到凋亡的刺激时，具有引起细胞染色体凝聚及DNA片段化的作用。

使用方法

1、加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

2、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

3、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

4、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

5、温育：操作同3。

6、洗涤：操作同5。

7、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.

8、终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于凋亡诱导因子在慢性氟中毒大鼠脑组织神经细胞凋亡中的作用研究

通过检测慢性氟中毒大鼠脑组织中神经细胞凋亡率、凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)和相关凋亡因子caspase在蛋白表达的水平,了解AIF介导的非caspase依赖性细胞凋亡途径是否参与慢性氟中毒大鼠大脑神经细胞凋亡过程,并探讨其发生机制。

方法:实验用Sprague Dawley(SD)大鼠60只,雌雄各半,随机分为两组,即正常对照组:自由饮用自来水,饮水中含氟量<0.5 mg/L;染氟组:饮水中加入氟化钠,使氟含量为50 mg/L。两组均饲以标准饲料(氟含量小于0.5mg/kg),实验期为10个月。

实验结束时,观察大鼠氟斑牙发生情况;用氟离子选择电极法测定大鼠尿氟、骨氟含量;HE染色观察大鼠大脑神经组织学改变,尼氏染色观察大鼠脑组织神经细胞内尼氏小体形态学改变;免疫组化检测大脑皮质及海马AIF分布;蛋白印迹(Western blotting)检测大脑皮质及海马AIF、caspase-3及caspase-9的蛋白表达水平;流式细胞术(flow cytometr,FCM)检测大鼠大脑皮质及海马细胞凋亡率。

结果:染氟成年大鼠出现不同程度的氟斑牙,尿氟及骨氟含量明显高于对照组(P<0.05);HE染色病理形态学检查显示,各组大鼠脑组织未见明显异常改变,尼氏染色发现染氟组大鼠脑组织神经细胞中尼氏体数量较对照组颜色变浅,数量减少;免疫组化结果显示,氟中毒组海马及皮质顶叶神经细胞AIF阳性表达率与染色程度明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。

参考文献

[1]Life with or without AIF[J].Emilie Hangen,Klas Blomgren,Paule Bénit,Guido Kroemer,Nazanine Modjtahedi.Trends in Biochemical Sciences.2010(5)

[2]Apoptosis-Inducing Factor and Colon Cancer[J].Alejandro Millan,Sergio Huerta.Journal of Surgical Research.2009(1)

[3]Transforming Growth Factor-β1-Mediated Slug and Snail Transcription Factor Up-Regulation Reduces the Density of Langerhans Cells in Epithelial Metaplasia by Affecting E-Cadherin Expression[J].Michael Herfs,Pascale Hubert,Natalia Kholod,Jean Hubert Caberg,Christine Gilles,Geert Berx,Pierre Savagner,Jacques Boniver,Philippe Delvenne.The American Journal of Pathology.2008(5)

[4]Evidence of a Role for Lactadherin in Alzheimer’s Disease[J].Jacques Boddaert,Kiyoka Kinugawa,Jean-Charles Lambert,Fatiha Boukhtouche,Joffrey Zoll,Régine Merval,Olivier Blanc-Brude,David Mann,Claudine Berr,JoséVilar,Béatrice Garabedian,Nathalie Journiac,Dominique Charue,Jean-Sébastien Silvestre,Charles Duyckaerts,Philippe Amouyel,Jean Mariani,Alain Tedgui,Ziad Mallat.The American Journal of Pathology.2007(3)

[5]魏露莎.凋亡诱导因子在慢性氟中毒大鼠脑组织神经细胞凋亡中的作用[D].贵阳医学院,2015.