小鼠抗β-Tubulin单克隆抗体的应用

背景^[1-3]

小鼠抗β-Tubulin单克隆抗体是以β-Tubulin为抗原的免疫蛋白，可以特异性结合β-Tubulin，主要用于检测β-Tubulin的Western blotting、Immunohistocry、ELISA、IF、IHC-P、IHC-F等生物实验。

Tubulin即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分别为55kDa和50kDa，其实际检测条带均在55kDa左右。作为内参，β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照，α-Tubulin和β-Tubulin构成微管蛋白的结构也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

β1-微管蛋白，有时称为VI类β-微管蛋白，在氨基酸序列水平上最不同。它仅在人类的巨核细胞和血小板中表达，并且似乎在血小板的形成中起重要作用。当VI类β-微管蛋白在哺乳动物细胞中表达时，它们会导致微管网络的破坏，微管碎片的形成，并最终导致巨核细胞和血小板中存在边缘带状结构。

内参抗体虽然选择较多，但是也需要遵循一定的原则，并契合实际的应用要求。首先，我们需要考虑目的蛋白的大小，我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参，由于β-Tubulin的检测分子量大约在55kD，因此该内参抗体不是很适合用于检测50kD-60kD大小目标蛋白的WB实验中。

应用^[4][5]

用于禾谷镰孢菌Fusarium graminearumα、β2-微管蛋白的原核表达、体外聚合及药物结合研究

在大肠杆菌中表达了禾谷镰孢菌α、β-微管蛋白,并进行了体外聚合及药剂结合研究,结果如下：以禾谷镰孢菌cDNA为模板,PCR扩增出α1、α2-微管蛋白基因,将其克隆到pET30a+表达载体上,转化到宿主菌Rossatta(DE3)pLysS,筛选阳性克隆,进行蛋白诱导表达。SDS-PAGE及Western-blot结果表明：融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为52.1kD和55.9kD；

融合蛋白能与抗His-tag的单抗发生特异性反应。通过对包涵体洗涤及透析复性后采用HisTrapTMHP Columns对融合蛋白进行纯化,可以得到纯度较高的微管蛋白。以构建好的(pET32a-β2-tubulin)重组质粒为模板,PCR扩增出p2-微管蛋白基因,将其克隆到pET30a+表达载体上,并转化到宿主菌BL21(DE3)及Rossatta(DE3)pLysS,筛选阳性克隆,进行蛋白诱导表达,并筛选蛋白可溶性表达的诱导因子；对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot验证。

最终获得了在大肠杆菌中表达效率高的阳性克隆；通过对诱导温度、诱导物浓度、诱导时间、初始诱导时的菌液浓度、培养液、诱导物种类及宿主菌等七因子的综合分析,获得了β2-微管蛋白可溶性表达的诱导条件；

利用HisTrapTM HP Columns对p2-微管蛋白进行纯化,可获得纯度很高的可溶性β2-微管蛋白。SDS-PAGE确认表达出的融合蛋白分子量约为51.6kD;Western-blot证实表达的融合蛋白能与His-tag及p-微管蛋白的单克隆抗体发生特异性反应。

参考文献

[1]Localisation of the benzimidazole fungicide binding site of Gibberella zeaeβ2‐tubulin studied by site‐directed mutagenesis[J].JianBoQiu,JianQiangXu,JunJieYu,ChaoWeiBi,ChangJunChen,MingGuoZhou.Pest.Manag.Sci..2011(2)

[2]Molecular cloning and biochemical characterization ofα-andβ-tubulin from potato plants(Solanum tuberosum L.)[J].Bon-Sung Koo,Satish Kalme,Soo-Hwan Yeo,Su-Jae Lee,Moon-Young Yoon.Plant Physiology and Biochemistry.2009(9)

[3]Effects of carbendazim on conidial germination and mitosis in germlings of Fusarium graminearum and Botrytis cinerea[J].Chao-Wei Bi,Jian-Bo Qiu,Ming-Guo Zhou,Chang-Jun Chen,Jian-Xin Wang.International Journal of Pest Management.2009(2)

[4]Theβ-tubulin gene as a molecular phylogenetic marker for classification and discrimination of the Saccharomyces sensu stricto complex[J].Chien-Hsun Huang,Fwu-Ling Lee,Chun-Ju Tai.Antonie van Leeuwenhoek.2009(2)

[5]徐建强.禾谷镰孢菌Fusarium graminearumα、β_2-微管蛋白的原核表达、体外聚合及药物结合研究[D].南京农业大学,2012.