人白介素2(IL-2)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人白介素2(IL-2)ELISA KIT是基于经典的双抗夹心ELISA方法，利用HRP偶联的抗体，催化TMB产生颜色物质，基于标准曲线，计算出样品中人白介素2的含量。

检测原理：双抗体夹心法测定标本中人白介素2(IL-2)水平。用纯化的人白介素2(IL-2)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人白介素2(IL-2)，再与HRP标记的人白介素2(IL-2)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人白介素2(IL-2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人白介素2(IL-2)浓度。

IL-2即白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2），又名T细胞生长因子（T cell growth factor，TCRF）主要由活化的CD4+Th1细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子.可促进Th0和CTL的增殖，故为调控免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。

白介素2首先被发现对骨髓来源的T细胞有生长促进作用。此后，发现IL-2的作用谱越来越广，包括对T、B细胞、NK细胞、LAK细胞、单核巨噬细胞和少突胶质细胞都有直接的促进生长和分化作用。作用通过细胞膜上的IL-2受体而实现。由于IL-2对免疫系统所具有的广泛作用，其在临床上有着良好的应用。

人的IL-2的前体有153个氨基酸。成熟形态有133个氨基酸，分子量为15.5KDa的糖蛋白。白介素-2是辅助型T淋巴细胞(TH)活化产生的细胞因子。IL-2具有双重调控免疫应变的能力,可有效诱导细胞免疫和体液免疫应答。

应用^[4][5]

用于重组人白介素-2（IL—2）突变体克隆及在巴斯德毕赤酵母系统中的表达与纯化研究

在毕赤酵母中高效表达hIL-2cDNA，获得hIL-2蛋白，拟对天然型hIL-2进行改构以获得新的突变体，同时进行活性测定，以便深入了解hIL-2的结构与功能的关系。

方法：用PCR法从白细胞介素-2（IL-2）cDNA全序列中扩增成熟的肽基因片段，并利用定点突变技术将人重组白细胞介素-2第125位游离的半胱氨酸编码序列突变为丙氨酸序列；编码18位亮氨酸的序列突变为蛋氨酸序列；编码19位亮氨酸的序列突变为丝氨酸序列，经限制酶酶切片段分析与DNA序列分析证明后，获得三突变体MvhIL-2。IL(2基因片段与酵母中间载体pPIC9K融合后，转化到大肠杆菌TOP10F’，扩增质粒，获取大量pPIC9K-MvhIL-2DNA后，再转化毕赤酵母，并在毕赤酵母中表达突变蛋白(IL(2-C125A/L18M/L19S)。

利用IL(2依赖细胞株CTLL-2细胞对纯化的突变蛋白(IL-2-C125A/L18M/L19S)和野生型IL(2进行测活。

结果：本研究成功地构建IL(2突变体，并在毕赤酵母中得到表达。作为一种真核生物，毕赤酵母比起其它更高级的真核细胞表达系统来说有许多优点：例如在蛋白加工，蛋白折叠和转录后修饰等方面，同时，它又和大肠杆菌或啤酒酵母一样具有分子水平和基因水平操作容易的优点，比其它真核细胞表达系统如杆状病毒或哺乳动物组织培养更快，更容易，消耗更少，而且表达水平高，有10倍到100倍表达异源蛋白的能力。这些特点使毕赤酵母作为蛋白表达系统非常有用。

参考文献

[1]Strategies for optimal synthesis and secretion of heterologous proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Koti Sreekrishna,Robert G.Brankamp,Keith E.Kropp,Dale T.Blankenship,Jiu-Tsair Tsay,Phil L.Smith,Jonathan D.Wierschke,Arun Subramaniam,Lori A.Birkenberger.Gene.1997(1)

[2]Production and Purification of Recombinant Hirudin Expressed in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris[J].Stuart A.Rosenfeld,Daniel Nadeau,Joel Tirado,Gregory F.Hollis,Robert M.Knabb,Steve Jia.Protein Expression and Purification.1996(4)

[3]Yeast expression of the cytokine receptor domain of the soluble interleukin-6 receptor[J].Petra Vollmer,Malte Peters,Marc Ehlers,Harutaka Yagame,Takao Matsuba,Masahide Kondo,Kiyoshi Yasukawa,Karl-Hermann Meyer zum Büschenfelde,Stefan Rose-John.Journal of Immunological Methods.1996(1)

[4]Direct PCR Screening of Pichia pastorisClones[J].Stefan Linder,Manfred Schliwa,Eckhard Kube-Granderath.BioTechniques.1996(6)

[5]刘堰.重组人白介素-2（IL—2）突变体克隆及在巴斯德毕赤酵母系统中的表达与纯化[D].重庆大学,2002.