Anti-c-Myc tag抗体(HRP)的应用

背景^[1-3]

Anti-c-Myc tag抗体(HRP)是一类可以特异性结合c-Myc tag的多克隆抗体，主要用于检测c-Myc tag的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多种免疫学实验。

检测原理：双抗体夹心法测定标本中c-Myc tag水平。用纯化的c-Myc tag抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入c-Myc tag，再与HRP标记的c-Myc tag抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的c-Myc tag呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中c-Myc tag浓度。

标签蛋白抗体是一类经过亲和纯化的小鼠单克隆抗体。用于检测各种商品化表达载体上的标签序列（如：MyC、His、GST、HA等），籍以分析检测目的蛋白的表达含量及其功能。其原理是抗原—抗体反应，这些标签抗体可以高度特异地结合对应的标签融合蛋白。标签抗体是开展基因蛋白表达、信号转导和基因功能研究的常用工具。

c-MycTag多肽（c-Myc Tag Peptide）是一种合成的多肽，其氨基酸序列相当于人c-Myc蛋白C-末端的410-419序列。c-Myc Tag多肽是c-Myc融合蛋白的替代品，在免疫分析实验中用于竞争性结合anti-c-Myc抗体，c-Myc Tag多肽与抗体的结合是特异性的，因此，c-Myc Tag多肽是一种温和的、理想试剂可用于洗脱与anti-Myc单抗结合的Myc-tag融合蛋白。

应用^[4][5]

用于周期蛋白G2结合蛋白的筛选及初步功能研究

周期蛋白G2由定位于染色体4q21.21的CCNG2基因编码，N端有典型的周期蛋白框序列，C端含PEST基序。周期蛋白G2在小脑、胸腺、脾、前列腺和肾脏中表达较高，在细胞中主要分布于细胞质。周期蛋白G2的mRNA表达水平随细胞周期波动，表现为在晚S期最高，而在G2／M期开始降低。

研究显示，周期蛋白G2在HEK293和CHO(Chinese hamster ovary)细胞中瞬时表达可导致G1期停滞；进一步发现，周期蛋白G2的细胞生长抑制作用与周期蛋白G2-蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)复合物密切相关。

构建了周期蛋白G2与GAL4-BD的融合蛋白的表达载体，以周期蛋白G2为诱饵，应用MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3，筛选预转入酵母Y187的人胎脑cDNA文库(Pretransformed MATCHMAKER Human Fetal Brain cDNA Library)。选择58个克隆进行序列分析，结果表明它们代表35种不同cDNA，其中PPP2R5B(Homo sapiens protein phosphatase 2,regulatory subunit B(B56),beta isoform)是已经报道过的与周期蛋白G2结合的PP2A的B56β。

另外，有三种cDNA在阳性克隆中出现的重复次数较多，即有8个克隆为DAPPER1 cDNA、3个克隆为BPY2IP1 cDNA以及3个克隆为Clorfl87 cDNA。

为了验证DAPPER1、BPY2IP1和Clorfl87与周期蛋白G2的结合，构建了真核表达载体pCMV-Tag5A-DAPPER1、pCMV-Tag5C-BPY2IP1和pCMV-Tag5B-Clorfl87，与p3×Flag-7.1-G2共转染HEK293细胞，以结合有c-myc标签抗体的琼脂糖树脂(Anti-c-Myc Agarose conjugate)沉淀与DAPPER1、BPY2IP1和Clorfl87结合的复合物。样品经SDS-PAGE分离后用Flag单抗进行Western Blot检测。

参考文献

[1]Kamibayashi,C,Serrano,M.Prives,C,Mumby,M.C.Beach,D.(1996)p53-dependent association between cyclin G and the B’subunit of protein phosphatase 2A.Okamoto,K.Molecular and Cellular Biology.

[2]Craig EA(1996)Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast.James P,Halladay J.Genetics.

[3]Burgess WH,Miki T,Bottaro DP,Kraus MH and Aaronson SA(1999)Isolation and biochemical characterization of the human Dkk-1 homologue,a novel inhibitor of mammalian Wnt signaling.Fedi P,Bafico A,Nieto Soria A.Journal of Biological Chemistry.

[4]Zolnierowicz,S.Hemmings,B.A.(1999)Regulation of protein kinase cascades by protein phosphatase 2A.Millward,T.A.Trends in Biochemical Sciences.

[5]于敏.周期蛋白G2结合蛋白的筛选及初步功能研究[D].中国协和医科大学,2005.