COLO205细胞的应用

背景^[1-3]

COLO205细胞是1957年由T.U.Sample等从患有结肠癌的70岁男性白人的腹水中分离的。该病人在取腹水样品前已用5-氟尿嘧啶治疗4~6周。角蛋白免疫过氧化物酶染色阳性。

COLO205人结肠癌细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。

应用^[4][5]

用于shRNA介导PIAS3表达下调对人结肠癌COLO205细胞增殖和凋亡的影响研究

检测取自人体不同部位、不同Dukes分期的人结肠癌细胞株SW480(取自结肠癌组织,Dukes B期)、SW620(取自结肠癌淋巴转移组织,Dukes C期)及COLO205(取自结肠癌腹腔转移腹水组织,Dukes D期)中PIAS3的表达水平,筛选PIAS3相对高表达细胞株进行shRNA质粒转染干预实验。

通过转染PIAS3shRNA质粒,下调结肠癌细胞株中PIAS3基因的表达水平,研究该基因的差异性表达对结肠癌细胞增殖活性、凋亡和细胞周期的影响。

方法：运用实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)检测SW480、SW620及COLO205三种入结肠癌细胞株中PIAS3基因的表达水平；运用脂质体介导将PIAS3shRNA质粒及无关序列shRNA对照质粒转染入人结肠癌细胞株,干预后区分为：PIAS3shRNA转染组(转染PIAS3shRNA质粒)、无关序列shRNA转染组(转染无关序列对照质粒)及空白对照组(不进行转染干预)。

采用Real-Time PCR.Western blot检测质粒转染干预对PIAS3基因的抑制效果；MTT(噻唑蓝)法检测PIAS3表达下调对结肠癌细胞增殖活性的影响；流式细胞仪检测PIAS3表达下调对人结肠癌细胞周期和凋亡的影响。

参考文献

[1]Molecular analysis of functional redundancy among anti-apoptotic Bcl-2 proteins and its role in cancer cell survival[J].Joshua M.Eichhorn,Sarah E.Alford,Nandini Sakurikar,Timothy C.Chambers.Experimental Cell Research.2014(2)

[2]PIAS3 activates the intrinsic apoptotic pathway in non‐small cell lung cancer cells independent of p53 status[J].Snehal Dabir,Amy Kluge,Karen McColl,Yu Liu,Minh Lam,Balazs Halmos,Gary Wildey,Afshin Dowlati.Int.J.Cancer.2014(5)

[3]Alloprimed CD8+T Cells Regulate Alloantibody and Eliminate Alloprimed B Cells Through Perforin‐and FasL‐Dependent Mechanisms[J].J.M.Zimmerer,T.A.Pham,C.L.Wright,K.J.Tobin,P.B.Sanghavi,S.M.Elzein,V.M.Sanders,G.L.Bumgardner.American Journal of Transplantation.2014(2)

[4]miR-125b Inhibitor May Enhance the Invasion-Prevention Activity of Temozolomide in Glioblastoma Stem Cells by Targeting PIAS3[J].Lei Shi,Yi Wan,Guan Sun,Shuguang Zhang,Zhimin Wang,Yanjun Zeng.BioDrugs.2014(1)

[5]李和平.shRNA介导PIAS3表达下调对人结肠癌COLO205细胞增殖和凋亡的影响[D].新疆医科大学,2014.