电转感受态细菌制备试剂盒的应用

背景^[1-3]

电转感受态细菌制备试剂盒是一种通过甘油溶液制备的，耐受电击刺激，快速吸收DNA的特定状态的常用大肠杆菌细胞。其适宜于原核或真核生物基因组DNA导入、大质粒转染、噬菌体表面展示技术、重组DNA实验等。产品即到即用，性能稳定，操作方便，电转状态恒定，转染效率高。

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌细胞，并使其生物学特性发生可遗传的变化的过程,利用理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对树生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。

转化方法:

1.在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA，冰上培育约5分钟

2.添加1-3μl DNA，冰上培育约5分钟

3.转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中

4.加载P1000，准备好300μl LB或2xYT

5.对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆,25μFd,2.5千伏）（检查时间常数，应该在3以上）

6.立即添加300μl的LB或2xYT至电穿孔容器中

7.37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原

8.转移细胞至适当的选择培养基上培养

应用^[4][5]

用于大肠杆菌cDNA文库的建立及与RNaseⅢ有相互作用蛋白的筛选研究

以大肠杆菌RNase III在原核生物中的作用为切入点,采用细菌双杂交的方式从构建的细菌cDNA文库中钓取与大肠杆菌RNaseⅢ有相互作用的蛋白,并研究这些蛋白与RNase III在原核生物处理外来RNA过程中所起的作用,以帮助确认原核生物中是否存在类似真核生物的RNA干扰过程。

采用stratagene公司的cDNA文库构建试剂盒构建大肠杆菌的cDNA文库。用Trizol试剂提取大肠杆菌的总RNA,在E.coli poly(A)Polymerase作用下给mRNA特异性地加上poly(A)尾,分离纯化mRNA,利用mRNA作为模板反转录合成双链DNA。经pfx酶补平双链末端,在两端加上EcoRI接头,XhoⅠ酶切消化产生粘性末端。

用CHROMA SPIN-400column分级分离纯化cDNA片段,与pTRG XR载体连接后,电击转入XL1-BLUE MRF’菌电转感受态中。

得到原始文库,经计算文库的容量达到3×106个克隆。用PCR方法测得文库的重组率为100%,插入片段的平均长度基本位于300bp以上,测定放大文库的滴度为：3.15×1010pfu/mL。说明构建的大肠杆菌cDNA文库质量比较高,适合用于筛选目的基因克隆。

文库的筛选,将pBT-RNaseⅢ质粒和pTRG-cDNA文库质粒电击共转入XL1-BLUE MRF’筛选菌中。在筛选平板上两次筛选后得到379个克隆,挑取这379个克隆做菌落PCR,对PCR产物按大小分组后再经MSP I酶切,剔除酶切片段一致的克隆,最终得到169个克隆。

其中有35个克隆重复次数达到三次以上,全部测序后在NCBI中做BLAST比对,发现大部分的克隆为16SrRNA和23SrRNA,也发现一些与糖代谢有关的酶,如吡哆醛激酶、转酮醇酶、异柠檬酸脱氢酶等,或许细菌RNaseⅢ酶也参与细菌的糖代谢。

参考文献

[1]Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression[J].Lei S.Qi,Matthew H.Larson,Luke A.Gilbert,Jennifer A.Doudna,Jonathan S.Weissman,Adam P.Arkin,Wendell A.Lim.Cell.2013

[2]DNA,RNA,and Protein Extraction:The Past and The Present[J].Siun Chee Tan,Beow Chin Yiap,Joakim Lundeberg.Journal of Biomedicine and Biotechnology.2009

[3]The Repetitive DNA Elements Called CRISPRs and Their Associated Genes:Evidence of Horizontal Transfer Among Prokaryotes[J].James S.Godde,Amanda Bickerton.Journal of Molecular Evolution.2006(6)

[4]Genetic uncoupling of the dsRNA‐binding and RNA cleavage activities of the Escherichia coli endoribonuclease RNase III—the effect of dsRNA binding on gene expression[J].S.Dasgupta,L.Fernandez,L.Kameyama,T.Inada,Y.Nakamura,A.Pappas,D.L.Court.Molecular Microbiology.2002(3)

[5]肖业.大肠杆菌cDNA文库的建立及与RNaseⅢ有相互作用蛋白的筛选[D].湖南师范大学,2014.