FITC标记的CD30抗体的应用

背景^[1-3]

FITC标记的CD30抗体是一类可以特异性结合CD30的多克隆抗体，主要用于检测CD30的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多种免疫学实验。

免疫荧光bai技术是将荧光素如异硫氰du酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)与相应抗体（zhi或抗原）以化学的方法结合，将dao荧光标记抗体（或抗原）与标本中相应的抗原结合形成荧光标记的抗体-抗原复合物，用荧光显微镜观察。在镜下见到有荧光存在即推断有抗原抗体复合物的存在，根据已知的抗体（或抗原）即可推知另一个未知抗原（或抗体）的存在。

检测原理：双抗体夹心法测定标本中CD30水平。用纯化的CD30抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入CD30，再与HRP标记的CD30抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的CD30呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中CD30浓度。

CD30是TNF受体超家族的成员。该受体通过活化的T细胞和B细胞表达，但不通过静止的T细胞和B细胞表达。TRAF2和TRAF5可以与该受体相互作用，并介导导致NF-κB活化的信号转导。该受体是细胞凋亡的正调节剂，并且还显示出它可以限制自身反应性CD8效应T细胞的增殖潜能并保护人体免受自身免疫。

应用^[4][5]

用于靶向CD30抗体偶联药物的制备及其抗淋巴瘤活性研究

通过基因工程技术将LDP偶联到抗CD30抗体的轻链N端,构建融合蛋白anti-CD30-LDP,并采用CHO表达系统获得目的蛋白。通过ELISA、Biacore、流式细胞术等方法验证融合蛋白与重组CD30抗原及CD30+肿瘤细胞的亲和活性,通过免疫荧光共聚焦检测其能否通过抗原介导的内吞作用进入细胞,并通过活体成像技术监测其在荷瘤小鼠体内的靶向性。

在此基础上,将活性发色团AE与anti-CD30-LDP进行组装,获得ADC药物anti-CD30-LDM,通过CCK-8、流式细胞术、Western Blot等实验检测其体外细胞杀伤活性和诱导凋亡的机制,并通过小鼠体内实验检测其对Karpas299移植瘤模型的抗肿瘤效果。研究结果:本研究应用CHO细胞表达体系,从大量单克隆细胞中筛选获得高表达目的蛋白的细胞株。

经细胞扩大培养和Protein G亲和层析柱分离纯化,得到融合蛋白anti-CD30-LDP,HPLC检测蛋白的纯度大于98%。ELISA、流式细胞术实验表明融合蛋白与重组CD30抗原及CD30+肿瘤细胞都具有很强的亲和性和特异性;通过Biacore实验计算其与重组CD30抗原的平衡解离常数为2.08 nmol/L,免疫荧光共聚焦实验表明融合蛋白能通过抗原介导的内吞进入细胞并被转运至溶酶体。小动物活体成像也表明融合蛋白在荷瘤小鼠体内具有很好的肿瘤靶向性,并延长了LDP在肿瘤部位的滞留时间。

组装发色团AE后,anti-CD30-LDM对CD30+细胞具有很强的增殖抑制和杀伤活性,IC50值(半数抑制浓度,half-maximal inhibitory concentration)在0.005～0.05 nmol/L之间,并将细胞周期阻滞在G2/M期进而促进细胞凋亡。动物实验结果显示,anti-CD30-LDM给药剂量为0.7mg/kg时抑瘤率为87.76%,并且无明显毒副作用。

参考文献

[1]Five-year outcomes for frontline brentuximab vedotin with CHP for CD30-expressing peripheral T-cell lymphomas[J].Michelle A.Fanale,Steven M.Horwitz,Andres Forero-Torres,Nancy L.Bartlett,Ranjana H.Advani,Barbara Pro,Robert W.Chen,Andrew Davies,Tim Illidge,Mayur Uttarwar,Shih-Yuan Lee,Hong Ren,Dana A.Kennedy,Andrei R.Shustov.Blood.2018(19)

[2]Inotuzumab Ozogamicin:First Global Approval[J].Yvette N.Lamb.Drugs.2017(14)

[3]Five-year survival and durability results of brentuximab vedotin in patients with relapsed or refractory Hodgkin lymphoma[J].Robert Chen,Ajay K.Gopal,Scott E.Smith,Stephen M.Ansell,Joseph D.Rosenblatt,Kerry J.Savage,Joseph M.Connors,Andreas Engert,Emily K.Larsen,Dirk Huebner,Abraham Fong,Anas Younes.Blood.2016(12)

[4]Anaplastic large cell lymphoma in paediatric and young adult patients[J].Suzanne D.Turner,Laurence Lamant,Lukas Kenner,Laurence Brugières.British Journal of Haematology.2016(4)

[5]王蓉.靶向CD30抗体偶联药物的制备及其抗淋巴瘤活性研究[D].北京协和医学院,2018.