一步法感受态细菌制备试剂盒的应用

背景^[1-3]

一步法感受态细菌制备试剂盒采用经济快速的方法高效制备大肠杆菌感受态细胞，在传统方法的基础上简化了操作步骤，提高了感受态细菌的转化效率。该试剂盒已被成功地用于从多种大肠杆菌菌株细胞制备感受态细胞，其中包括常用的克隆株（JM109，DH5α，TOP10等）和表达菌株（BL21家族）用于基因克隆、质粒扩增或重组蛋白的表达。

该试剂盒可采用两种方法制备感受态细胞：标准制备法和快速制备法。这两种方法制备感受态细胞比传统CaCl2法和Hanahan法更加简单快捷，不需要0~4°C孵育和传统的热击处理。采用快速方法制备的感受态细胞pUC 18质粒转化大肠杆菌JM109的转化效率大于1.0×105 cfu/µg；使用标准方法的转化效率大于1.0×106 cfu/µg。

感受态细胞制备流程：

1.在平板上挑取单克隆或冻存的甘油菌，接种至2-5 ml合适的培养基中，37°C培养过夜。

2.将过夜培养的菌液按1:100稀释比例加入到预热的新鲜LB培养基中，250 rpm 37°C培养至细菌生长至早对数期

（OD600=0.3~0.4）时，时间通常为1.5~3 h。

3.将上述培养好的菌液于3,500~5,000 rpm，4°C离心5~10 min，收集细胞。

4.按照每mL培养菌液加入100µl Buffer的比例加入前边准备好的冰上预冷的1×BT buffer T，用吸头充分悬浮细胞，冰上

放置10 min。可直接用于转化或分装后用液氮冻存，-70°C保存备用。

应用^[4][5]

用于铜绿假单胞菌噬菌体PaP3生物学特性的研究与噬菌体基因组改造的技术准备

溶原性噬菌体通过自身携带的外源性遗传物质改变着宿主菌及自身的基因组构成,进而改变了宿主菌的生物学性状,对噬菌体展开广泛深入的研究对于了解噬菌体与宿主的相互作用、揭示生物的多样性等方面具有重要的意义。因此,噬菌体及其基因组功能的研究成为微生物学研究的热点领域之一。

改造后PaP3基因组电转化宿主菌。PaP3基因组电转化宿主菌的条件摸索。纯化噬菌体PaP3完整基因组DNA,以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PA3为受体菌,探讨电转化基本条件,包括:细胞生长状态、感受态细胞的制备方式、电场强度、DNA浓度、细胞密度等条件对转化效率的影响。

确定了一组适用于电转化噬菌体PaP3基因组DNA的条件:在含50μg/ml红霉素的LB培养基中培养宿主菌14h—16h,以100mM蔗糖溶液为介质,在25℃条件下制备感受态细胞,适宜的感受态细胞浓度为1011/ml,适宜的电转参数为12kV/cm,300Ω,25μF。在此条件下获得较高的转化效率,可达2.1×103pfu/μg DNA。这为改造后噬菌体基因组的电转奠定了基础。

参考文献

[1]Whole genome sequencing of a novel temperate bacteriophage of P.?aeruginosa:evidence of tRNA gene mediating integration of the phage genome into the host bacterial chromosome[J].YinlingTan,KebinZhang,XiancaiRao,XiaolinJin,JianjunHuang,JunminZhu,ZhijinChen,XiaomeiHu,XiaodongShen,LinWang,FuquanHu.Cellular Microbiology.2006(2)

[2]Use of Bacteriophages in Combination with Competitive Exclusion to Reduce Salmonella from Infected Chickens[J].H.Toro,S.B.Price,S.McKee,F.J.Hoerr,J.Krehling,M.Perdue,L.Bauermeister.Avian Diseases.2005(1)

[3]Bacterial viruses as human vaccines?[J].Clark,March.Expert Review of Vaccines.2004(4)

[4]Bacteriophage lambda is a highly stable DNA vaccine delivery vehicle[J].Catherine D.Jepson,John B.March.Vaccine.2004(19)

[5]周莹冰.铜绿假单胞菌噬菌体PaP3生物学特性的研究与噬菌体基因组改造的技术准备[D].第三军医大学,2006.