CELL COUNTING KIT-8 (CCK-8试剂盒)的应用

背景^[1-3]

CELL COUNTING KIT-8(CCK-8试剂盒)是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

WST-8工作原理：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450 nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。

WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比线性范围更宽，灵敏度更高。

CCK-8试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。

试剂盒仅一管已经配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，无须再进行任何配制等操作。无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外的步骤去溶解formazan。可以用于大批量样品的检测。酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。

WST-8对细胞无明显毒性。加入CCK-8溶液显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到测定时间。

应用^[4][5]

用于体外抗肿瘤药物筛选中CCK-8、MTT和SRB法的比较研究

比较CCK-8、MTT、SRB三种检测细胞增殖方法的相关性、重复性、稳定性和灵敏性，探讨使用三种方法进行抗肿瘤药物体外筛选的适应性。方法将悬浮生长的人红细胞白血病细胞K562和贴壁生长的人肝癌细胞HepG2调整成1×103～1×106／ml之间的十个细胞浓度种于96孔板，分别用CCK-8、MTT和SRB法检测其光密度（OD）值，比较三种方法的相关性；

三种方法分别重复三次，比较其重复性；于九个不同时间点测定其OD值，比较其稳定性；检测四个待测样品和两个已知抗肿瘤药对两株细胞的增殖抑制率，比较其灵敏性。

结果三种方法测得两株细胞的OD值与细胞密度的相关系数（r）大于0.888（P＜0.05）。三种方法重复三次测得的OD值之间的相关系数大于0.956（P＜0.05）。CCK-8法和MTT法测得的OD值随时间的延长而增加：CCK-8法72h测得的OD值为0h的6～7倍（P＜0.05），MTT法72h测得的OD值为0h的1.5倍（P＜0.05）左右，而SRB法1～72h不同时间点测得的OD值与0h相比无显著性差异（P＞0.05）。

六个受试物分别用MTT法和SRB法测得的K562和HepG2半数抑制浓度(IC50)无显著性差异（P＞0.05），而用CCK-8法测得的IC50低于MTT法和SRB法测得的结果（P＜0.05），以顺铂为例，MTT法和SRB法测得的IC50值约是CCK-8法的2～4倍和6倍。结论CCK-8、MTT、SRB法测得的OD值与细胞数目之间有良好的相关性；三种方法均有良好的重复性；SRB法的稳定性优于MTT法和CCK-8法；三种方法均可用于体外抗肿瘤药物筛选，贴壁细胞和悬浮细胞均适用，所得结果相似；CCK-8法较MTT法和SRB法更为灵敏和便捷，但实验成本相应增加，更适应于微量样品的大规模筛选。

参考文献

[1]Cytotoxic clerodane diterpenoids from the leaves of Premna tomentosa[J].Young-Won Chin,William P.Jones,Qiuwen Mi,Ismail Rachman,Soedarsono Riswan,Leonardus B.S.Kardono,Hee-Byung Chai,Norman R.Farnsworth,Geoffrey A.Cordell,Steven M.Swanson,John M.Cassady,A.Douglas Kinghorn.Phytochemistry.2006(12)

[2]neo-Clerodane diterpenoids from Scutellaria barbata with cytotoxic activities[J].Sheng-Jun Dai,Jia-Yi Tao,Ke Liu,Yong-Tao Jiang,Li Shen.Phytochemistry.2006(13)

[3]Briaexcavatins C–F,four new briarane-related diterpenoids from the Formosan octocoral Briareum excavatum(Briareidae)[J].Ping-Jyun Sung,Yu-Pei Chen,Tsong-Long Hwang,Wan-Ping Hu,Lee-Shing Fang,Yang-Chang Wu,Jan-Jung Li,Jyh-Horng Sheu.Tetrahedron.2006(24)

[4]CF mediated G1 arrest is associated with induction of p27 Kip1 and inhibition of cyclin D1 expression in human hepatoma HepG2 cells[J].Ye Jian,Wang JingZe.Hepatology Research.2006(2)

[5]杨兵兵.1.体外抗肿瘤药物筛选中CCK-8、MTT和SRB法的比较研究2.37个二萜化合物体外抗肿瘤活性和作用机制研究以及构效关系分析[D].昆明医学院,2007.