提高肌酸酶稳定性的方法

背景及概述^[1]

肌酸酶(creatinase；EC 3.5.3.3；CRE)属于水解酶类，催化肌酸水解产生尿素和肌氨酸，是肌酐代谢中的关键酶。目前在多种细菌中均发现肌酸酶的存在，除了极少数来源的肌酸酶以单亚基的形式存在，大多数肌酸酶都是同源二聚体，其中对Pseudomonasputida来源的肌酸酶研究最多。

提高稳定性的方法^[1-2]

报道一、

阮洁等人为提高肌酸酶（Creatinase,EC 3.5.3.3,CRE）的热稳定性,通过序列比对的方法确定了Arthrobacter nicotianae 23710 CRE热稳定性相关位点K195,并对其进行饱和突变。与野生酶相比,突变体K195V、K195T、K195C和K195L在50℃下的半衰期分别提高260%、 230%、60%和20%;其中,K195V和K195C比酶活分别提高80.7%和88.2%,其他突变体比酶活无明显变化;突变体K195V、K195T、K195C和K195L的催化效率(kcat/Km)分别提高131%、 218%、 83%和100%。结构分析发现,突变体K195V、 K195T、 K195L较野生酶分别增加了7、12和13个氢键。结果表明:对Lys195的突变可有效改变CRE的热稳定性及催化效率,且分子内部氢键的增加可能是CRE热稳定性提高的重要原因之一。

报道二、

CN201710376236.9提供一种提高肌酸酶pH稳定性的方法，所述方法是利用多聚赖氨酸对同源二聚体肌酸酶(NCBI上GenBank：CAA00921.1)进行化学修饰。采用本发明的方法，经多聚赖氨酸修饰后，在肌酸酶表面形成“分子捆绑”作用，在一定程度上增强亚基间相互作用，有效防止了肌酸酶亚基在酸碱性条件下的解聚，有效减少酶失活；肌酸酶经修饰后，表面氨基增多，也会对外界酸碱环境的变化有一定的缓冲作用。采用本发明的方法制备得到的肌酸酶，pH稳定性由6-8提高至4-10，pH稳定性提高，而kcat/Km仅仅降低24％。此方法条件温和，操作简单，更加适合工业化应用，为肌酸酶在医疗诊断等领域的应用提供了方便。而且本发明的方法也为其他多亚基酶的稳定性改造提供了一条可行的途径。

步骤1、肌酸酶分子表面酸性氨基酸分析

多聚赖氨酸的共价修饰取决于酶表面的酸性氨基酸的个数，根据肌酸酶的氨基酸序列及结构(PDB ID:1CHM)分析，Pseudomonasputida来源肌酸酶含有108个酸性氨基酸，其中 76个酸性氨基酸位于酶分子的表面，且侧链官能团暴露于酶表面，可以参与酶分子表面poly-lysine的修饰。

步骤2：多聚赖氨酸修饰肌酸酶

肌酸酶表面羧基与poly-lysine氨基摩尔比分别为1:20、1:50、1:100、1:150和1:200，CRE-COOH与EDC的摩尔比为1:10、反应pH为7.0，4℃缓慢转动混匀过夜，计算相对酶活力；将不同的摩尔比例获得的修饰酶超滤除去未结合的小分子修饰剂，置于不同pH值的缓冲溶液(pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)中，25℃放置16h，测定酶活力，以游离酶或修饰酶最适pH条件下的酶活力为100％计算相对活性，确定酶的pH稳定性。结果如表1所示。表1不同肌酸酶表面羧基与多聚赖氨酸氨基比例修饰酶的pH稳定性

参考文献

[1] [中国发明,中国发明授权] CN201710376236.9 一种提高肌酸酶pH稳定性的方法

[2]阮洁,刘松,李江华,堵国成,陈坚.饱和突变提高肌酸酶热稳定性[J].食品与生物技术学报,2019,38(10):8-14.