人对氧磷酶(PON)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人对氧磷酶(PON)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中人对氧磷酶(PON)水平。用纯化的人对氧磷酶(PON)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入对氧磷酶1(PON1)，再与HRP标记的对氧磷酶(PON)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的对氧磷酶(PON)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人对氧磷酶(PON)浓度。

对氧磷酶（paraoxonase,PON）基因家族至少有三个成员，包括PON1，PON2和PON3，它们定位在染色体7q21.3-22.1。PON1基因产物，也叫血清对氧磷酶，不仅在有机磷神经毒剂解毒中起重要作用，而且与动脉粥样硬化、冠心病及2型糖尿病等疾病发病有密切关系。血清对氧磷酶能够催化磷酸酯键水解，降解有机磷酸酯、芳香羧酸酯和氨基甲酸酯，这是PON1对有机磷化合物中毒保护作用的分子基础。

但哺乳动物中PON1对有机磷的亲和性和转化率十分有限，因此，急性有机磷中毒时，PON1是没有机会发挥保护性作用的，只有在低水平和慢性中毒时，PON1才有时间和机会发挥作用。血清对氧磷酶的动物和体内实验表明，该蛋白可能有重要的病理生理学和药理学作用。随着分子生物学技术的发展，PON1基因产物的体外表达及基因治疗将成为可能，使其在有机磷农药中毒、心血管疾病和糖尿病血管并发症等救治中发挥重要作用。

应用^[4][5]

人对氧磷酶(PON)ELISA KIT用于人对氧磷酶1在毕赤酵母中的表达与酶学性质分析研究。

人对氧磷酶1(Human Paraoxonase 1,hPON1)是人体血液中的一种非专一性酯酶,可以水解多种有机磷化合物,已有研究显示,PON1具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化和解救有机磷中毒等作用,且PON1比现有的有机磷解毒剂有更好的解毒作用。然而,纯化天然来源的PON1操作困难且效率较低;而利用大肠杆菌表达系统,外源蛋白表达量虽高,但多以包涵体的形式表达,需要复性,且蛋白质折叠往往存在问题。采用巴斯德毕赤酵母表达系统,对hPON1进行胞内表达。首先,将hPON1基因经过密码子优化后克隆至pPICZA表达载体上,构建得到pPICZA-PON1重组表达质粒,经线性化后转化至巴斯德毕赤酵母X33菌株中,筛选得到阳性重组菌株。将重组菌株进行摇瓶发酵120 h,酶活力为0.15 U/mL。收集发酵液并细胞裂解后,用Ni-NTA螯合亲和层析的方法进行纯化,得到纯化的hPON1,SDS-PAGE结果显示表达产物的大小约37 kDa,与预期的蛋白分子量相符。其次,采用单因素试验与Box-Behnken组合设计方法进行有效结合的策略,通过对毕赤酵母中表达的发酵条件进行优化,提高rhPON1的表达量。优化条件为:甲醇浓度1.42%,初始培养基pH值5.91,培养基装液量9.39%,预测rhPON1理论酶活力为0.737 U/mL。在优化条件下得到的rhPON1酶活力0.735 U/mL,是在优化前条件下的酶活力的1.78倍。同时也考察了初始诱导菌体浓度对rhPON1表达量的影响,适当提高初始诱导菌体浓度能在诱导过程中促进rhPON1的表达,为进一步优化rhPON1在毕赤酵母中的表达提供依据。

参考文献

[1]Expression and purification of biologically active recombinant human paraoxonase 1 from inclusion bodies of Escherichia coli[J].Priyanka Bajaj,Rajan K.Tripathy,Geetika Aggarwal,Abhay H.Pande.Protein Expression and Purification.2015

[2]Species Differences in Paraoxonase Mediated Hydrolysisof Several Organophosphorus Insecticide Metabolites[J].Russell L.Carr,Mary Beth Dail,Howard W.Chambers,Janice E.Chambers,Maria Teresa Colomina.Journal of Toxicology.2015

[3]Human Paraoxonase 1 as a Pharmacologic Agent:Limitations and Perspectives[J].Priyanka Bajaj,Rajan K.Tripathy,Geetika Aggarwal,Abhay H.Pande,Srinivasa Reddy.The Scientific World Journal.2014

[4]Interplay between amino acid residues at positions 192 and 115 in modulating hydrolytic activities of human paraoxonase 1[J].Priyanka Bajaj,Geetika Aggarwal,Rajan K.Tripathy,Abhay H.Pande.Biochimie.2014

[5]于子桐.人对氧磷酶1在毕赤酵母中的表达与酶学性质分析[D].华南理工大学,2017.