小鼠骺软骨细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠骺软骨细胞取自小鼠小鼠骺骨生长板，骺骨生长板位于长骨两端骨骺和骨干之间的软骨组织。其中的软骨细胞可分裂、成熟、肥大，最终被骨组织所替换，对于长骨生长具有重要作用。骺板只存在单向软骨增殖与成骨活动，是生长期骨骼的生长发育部位。从组织学可分为四层：静止层（resting zone），增殖层（proliferation zone），肥大层（hypertrophy zone），钙化层(calcification zone)。当骺板发育至成熟阶段，其软骨增殖与成骨活动相继结束。最后，骺板完全骨化，骨骺与干骺端融合，长骨的纵向生长停止。严格区分，骨骺有两类，即受压力骨骺与受拉力骨骺，两者都有自己相应的骺板。

骨骺（epiphysis）是骨在发育过程中，骨两端的软骨中出现的骨化点。一般见于长骨两端、扁骨缘、结节、粗隆及突起等处。骨骺大部分骨化后，只在与骨干相邻部位留有一层软骨板，即骺软骨。通过软骨细胞的分裂增殖、骨化，使骨不断加长。全身各骨的骺软骨依一定的年龄次序停止增殖而骨化，骺软骨随之逐渐消失，从此长骨不再增长，不规则骨或扁骨不再扩大。成年后，骺软骨骨化，骨干与骺融合一体，在骺软骨留有遗迹称骺线。

应用^[4][5]

用于促甲状腺激素对小鼠原代软骨细胞增殖和分化的影响研究

亚临床甲状腺功能减退症(subclinicalhypothyroidism,SCH),简称亚甲减,是临床上常见的内分泌代谢性疾病。亚甲减患者虽然甲状腺激素水平在正常范围内,但是血清中促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)水平升高,偏离正常参考范围。研究证实,高TSH与甲状腺功能减退的小鼠骨骼发育异常有关。

方法1.小鼠原代软骨细胞(PMCs)的培养及处理:取小鼠膝关节,去除周围结缔组织,将软骨组织与深层软骨下骨仔细分离,缓冲液冲洗,剪碎软骨组织后用0.1%胶原酶消化18.5 h,离心去上清,依次经100μm和40μm滤网过滤。洗涤后用含10%胎牛血清(FBS)、1%双抗和100μM维生素C的培养液分散培养。隔天换液,待细胞融合度达到70%-80%时,换成含1%FBS的培养基分别以不同处理培养48h,尽可能减少血清中脂蛋白及各种激素对实验的干扰作用。

2. 用10 mU/ml bTSH处理PMCs特定的时间,设置对照组。用CCK8和EdU试剂盒检测细胞增殖活性。

3. 用JC-1检测细胞线粒体膜电位的改变来观察细胞凋亡情况。应用Western blot检测促凋亡因子Bax和Bcl-2的表达水平。

4. 用Western blot和免疫荧光染色检测自噬相关标志物如LC3、Beclin-1和p62,Western blot mTOR、p-AMPK和AMPK,用透射电镜检测PMCs的自噬情况。

5. 采用Alcian blue染色检测亚甲减小鼠和正常小鼠软骨蛋白聚糖的表达水平。通过免疫荧光染色检测collagen ll和collagen l的表达情况。

6. 通过RT-PCR检测不同整合素亚基的表达情况。

结果：CCK-8细胞增值活性检测发现,细胞活性在高浓度TSH(10 mU/ml)刺激24h后下降明显,低浓度组(1 mU/ml)在TSH刺激72h后,细胞增殖活性也比对照组产生显著降低(P<0.05),并持续下降。

参考文献

[1]Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy(3rd edition)[J].Daniel J Klionsky,Kotb Abdelmohsen,Akihisa Abe,Md Joynal Abedin,Hagai Abeliovich,Abraham Acevedo Arozena,Hiroaki Adachi,Christopher M Adams,Peter D Adams,Khosrow Adeli,Peter J Adhihetty,Sharon G Adler,Galila Agam,Rajesh Agarwal,Manish K Aghi,Maria Agnello,Patrizia Agostinis,Patricia V Aguilar,Julio Aguirre-Ghiso,Edoardo M Airoldi,Slimane Ait-Si-Ali,Takahiko Akematsu,Emmanuel T Akporiaye,Mohamed Al-Rubeai,Guillermo M Albaiceta,Chris Albanese,Diego Albani,Matthew L Albert,Jesus Ald.Autophagy.2016(1)

[2]Collagen II regulates chondroycte integrin expression profile and differentiation[J].Wei Xin,Juliane Heilig,Mats Paulsson,Frank Zaucke.Connective Tissue Research.2015(4)

[3]Acetyl-CoA carboxylase 2 suppression rescues human proximal tubular cells from palmitic acid induced lipotoxicity via autophagy[J].Wei Xin,Xu Zhao,Lei Liu,Ying Xu,Zhaoping Li,Liyong Chen,Xiaojie Wang,Fan Yi,Qiang Wan.Biochemical and Biophysical Research Communicatio.2015(3)

[4]The Selective Autophagy Receptor p62 Forms a Flexible Filamentous Helical Scaffold[J].Rodolfo Ciuffa,Trond Lamark,Abul K.Tarafder,Audrey Guesdon,Sofia Rybina,Wim J.H.Hagen,Terje Johansen,Carsten Sachse.Cell Reports.2015(5)

[5]于越.促甲状腺激素对小鼠原代软骨细胞增殖和分化的影响[D].山东大学,2017.