人凝血因子Ⅱ(FⅡ)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人凝血因子Ⅱ(FⅡ)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中人凝血因子Ⅱ(FⅡ)水平。用纯化的人凝血因子Ⅱ(FⅡ)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入凝血因子Ⅱ(FⅡ)，再与HRP标记的凝血因子Ⅱ(FⅡ)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的凝血因子Ⅱ(FⅡ)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人凝血因子Ⅱ(FⅡ)浓度。

凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分。它的生理作用是，在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起并且补塞血管上的漏口。这个过程被称为凝血。整个凝血过程大致上可分为两个阶段，凝血酶原的激活及凝胶状纤维蛋白的形成。它们部分由肝生成。可以为香豆素所抑制。凝血酶原血液凝固因子之一。存在于血浆中，亦称第Ⅱ因子。是凝血酶的前身物质，血浆中含量为10—15毫克/分升，分子量为68000的糖蛋白。糖的含量约占11%，其中含有半乳糖、甘露糖、岩藻糖、氨基已糖、唾液酸。遗传性凝血酶原（凝血因子Ⅱ)缺乏是最为罕见的遗传性出血病之一可以将凝血酶原缺乏分成两类：①低凝血酶原血症(Ⅰ型缺乏），以抗原和活性同时降低为特点；②异常凝血酶原血症(Ⅱ型缺乏)，特点是抗原水平正常或正常低限凝血酶原活性减低。

应用^[4][5]

人凝血因子Ⅱ(FⅡ)ELISA KIT用于尖吻蝮蛇血凝酶对凝血因子及其功能影响研究。

蛇毒中含有多种多样的蛋白酶影响机体的凝血过程。其中,有一类丝氨酸蛋白酶,类似或部分类似凝血酶,能直接作用于纤维蛋白原(Fib)释放纤维蛋白肽A(FpA)或B(FpB),导致纤维蛋白单体首尾聚合而凝固,具有促凝活性,称之为“蛇毒类凝血酶"(snake venom thrombin-like enzymes,SVTLEs)。尖吻蝮蛇血凝酶与Vik依赖凝血因子的结合特性研究1 NPAGE法定性验证尖吻蝮蛇血凝酶与富含GLa区的凝血因子的结合能力分别取24uMsaculin和16uMFX(FXa)/FIX(FIXa)/FVII(FVIIa)/FII等体积混匀后于37℃孵育90 min后取出一定量的反应液立即进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(NPAGE)。2尖吻蝮蛇血凝酶与FX(FXa)/FIX(FIXa)形成的复合物中各组分分子比例的研究将16uMsaculin和16uMFX(FXa)/FIX(FIXa)等体积混匀后于37℃孵育90 min后取出一定量的反应液立即进行NPAGE分析。

3 ELISA法定量检测尖吻蝮蛇血凝酶与富含GLa区的凝血因子的结合能力分别取10 nM的FX(FXa)/FIX(FIXa)/FVII(FVIIa)/FII包被酶标板,然后加入不同浓度的saculin溶液进行孵育,再加入saculin多克隆抗体和酶标二抗,加底物显色,酶标仪测OD值。吻蝮蛇血凝酶对凝血酶原复合物、FX激活物复合物功能的影响研究通过自制模拟血小板第3因子的磷脂囊泡(PCPS),并将各复合物中所包含的凝血因子成分组建在一起,体外构建这三种复合物(凝血酶原复合物:1.4 uM FII+20 nM FVa+40 uM PCPS+3 nM FXa;外源性FX激活物复合物:0.5 uM FX+20 nMFIII+40uMPCPS+3nMFVIIa;内源性FX激活物复合物:0.5uMFX+40uM PCPS+FVIII-FIIa混合物(8 IU/ml FVIII+16 nM FIIa)+3 nM FIXa),然后在saculin存在与不存在两种情况下对其功能进行检测。

参考文献

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[5]米鹏程.尖吻蝮蛇血凝酶对凝血因子及其功能影响研究[D].南方医科大学,2013.