重组人角质细胞生长因子-1的应用

背景^[1-3]

重组人角质细胞生长因子-1是FGF家族的23种已知成员之一。所有FGF具有两个保守的半胱氨酸残基，并且在氨基酸水平上具有30-50%的序列同一性。通过促进细胞增殖和分化，该家族的蛋白质在产前发育和出生后生长以及各种组织的再生过程中起重要作用。KGF-1是对上皮细胞和角质形成细胞特异的有丝分裂原因子，并通过FGF受体2b发出信号.KGF-1在肾和肺发育，血管生成和伤口愈合中是重要的

。

重组人角质细胞生长因子-1是人体皮下的组织细胞分泌的一种碱性蛋白生长因子，能特异刺激上皮细胞的新陈代谢等生理过程，包括细胞的再生、分化和迁移等。角质细胞因子又称FGF-10，是成纤维细胞生长因子(FGF)大家族中较晚被成功克隆的成员，也是人类基因组计划的一个商业化成果。

它是人机体内自然存在的一种具有活性的可溶性蛋白质，由194个氨基酸编码组成，成熟KGF有163个氨基酸残基，其N端有一个糖基化位点在人体内主要由皮下组织分泌，并特异性的结合到上皮细胞表面的特异受体经过复杂的信号传递过程，启动上皮细胞内参与分裂生长的基因表达，从而刺激上皮组织的新陈代谢。

生产制备角质细胞生长因子的技术路线如下：

1、目的基因(cDNA文库)克隆rhKGF-2表达载体，并经过转化、筛选、鉴定出高效可溶性表达工程菌；

2、工程菌大规模培养；

3、对发酵产物进行纯化得到rhKGF-2蛋白液；

4、添加稳定剂、赋形剂进行冷冻干燥。

应用^[4][5]

用于重组人角质细胞生长因子-I聚乙二醇修饰及体内外活性研究

大肠杆菌可溶性表达的重组人角质细胞生长因子-I型N端缺失23个氨基酸后的突变体（△N23KGF-I，简称△K23）的聚乙二醇修饰、纯化工艺及其体内外生物活性。

方法：（1)破菌，SP sepharose F.F纯化，复性和Heparinsepharose F.F纯化得到突变体纯品；

(2) 用mPEG-马来酰亚胺修饰截短重组人角质细胞生长因子-I（△K23）的游离巯基，然后胰蛋白酶酶切，采用液质联用技术，获得质量肽图。对比单体及修饰后的蛋白还原质量肽图和非还原质量肽图，确定PEG的修饰位点；

(3) 通过NBL-7细胞、大鼠五氟尿嘧啶肠粘膜损伤模型进行体内外生物活性评价。结果：获得的△K23单体的纯度能达到95%，工艺稳定；

通过对修饰工艺的研究，得到了两个不同的修饰产物：mPEG-Mal-△K23-40(缩写：PEG-K23-40)、mPEG-Mal-△K23-102(缩写：PEG-K23-102)。前者修饰在Cys40位，后者修饰在Cys102位，100mg级△K23样品修饰后纯度达到95%以上，而且修饰位点单一。经体外的NBL-7的细胞测活，△K23和PEG-K23-40、PEG-K23-102的活性保留了以KGF-1国际标准品作为对照品的生物活性的98%，65%，30%。在大鼠的肠粘膜损伤修复实验中，△K23和PEG-K23-40相对于模型组有明显的效果，PEG-K23-102的效果则不明显。

参考文献

[1]Liposomal Gene Transfer of Keratinocyte Growth Factor Improves Wound Healing by Altering Growth Factor and Collagen Expression[J].Clifford T.Pereira,David N.Herndon,Roland Rocker,Marc G.Jeschke.Journal of Surgical Research.2007(2)

[2]Physiological effects of ultrasound mist on fibroblasts[J].JengyuLai,Mark R.Pittelkow.International Journal of Dermatology.2007(6)

[3]HaCaT keratinocyte migration is dependent on epidermal growth factor receptor signaling and glycogen synthase kinase-3α[J].Experimental Cell Research.2006(15)

[4]Role of fibroblast growth factor receptor signaling in kidney development[J].Carlton M.Bates.Pediatric Nephrology.2007(3)

[5]冯一建.重组人角质细胞生长因子-I聚乙二醇修饰及体内外活性研究[D].重庆理工大学,2012.