人胚肾细胞293T的应用

背景^[1-3]

人胚肾细胞293T是293细胞株插入SV40 T-抗原的温度敏感基因后产生的高转染效率的衍生细胞株。

培养步骤

1）培养皿/瓶用枪头或移液管吸去原培养液；

2）无菌PBS或无菌生理盐水洗涤3次（按培养体积加入）；

3）加入适量胰酶消化适当时间（一般胰酶为0.25%；9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶，一次加入1mL胰酶。消化时间视细胞类型等多种情况综合考虑，一般如果是细胞株，非原代培养，消化1－2分钟足矣）；

4）用枪头吹打数十次（视细胞类型而定。一般细胞株30－50次吧，耗时一般2分钟左右）；

5）加入适量体积完全培养基终止胰酶消化（如果是9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶，可以加入1mL完全培养基；现在培养瓶（皿）里有2mL溶液）。

6）现在可以将溶液进行分瓶（2mL）。如果是细胞株，直接均分到两个培养瓶（皿）里。如果是原代培养，可以根据消化时间来对细胞进行分离；因此可以将溶液（2mL）都转入新的培养瓶（皿）。

7）将两个培养瓶（皿）补足完全培养基到正常体积（果是9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶，为5mL完全培养液）

8）镜下观察。刚刚传代细胞还没贴壁，悬浮在溶液中，呈圆形。一般2h之内会贴壁，如果已经贴壁，根据细胞类型有不同的形态，但通常都不是圆形。

9）镜下观察无误之后，再放入细胞培养箱。培养瓶（皿）放入之前，可以用消毒酒精先擦一下。

10）传代之后，*第二天细胞换液一次。当然，也可以视情况而定。

应用^[4][5]

用于被动靶向的磁共振成像及近红外成像双模态纳米探针研究

通过SPIO@PEG/HID与人胚肾细胞293T及人乳腺癌细胞株MCF-7共孵育的方法评价探针的毒性,体外成像光学及磁性成像效果,分析两种细胞内材料含量的差异性,进一步探讨该探针潜在肿瘤靶向性。研究探针体外成像能力及靶向能力。

材料及方法：将SPIO@PEG/HID纳米颗粒与人乳腺癌细胞株MCF-7共同孵育后,

(1) 通过普鲁士蓝染色定性观察细胞对SPIO@PEG/HED纳米颗粒吞噬情况；

(2) 采用二甲基四氮唑法(Microculture tetrazo lium assay,MTT)测SPIO@PEG/HID对细胞活力的影响,设置人胚肾细胞293T细胞作为对照组；

(3) 通过细胞透射电镜(TEM)分析纳米颗粒在细胞的分布：收集细胞悬液,用2.5%戊二醛溶液40℃固定1h,室温下1%四氧化锇溶液固定1h,PBS清洗2-3次,每次5min,梯度乙醇脱水,环氧树脂包埋,常规制作超薄切片,转移到铜网,透镜观察颗粒在细胞内的分布情况。

(4) 将SPIO@PEG/HID分别以20ug/mL、50ug/mL、100ug/mL的浓度与MCF-7及293T细胞共孵育24h,后分别收集细胞。

(5)将细胞重悬于1mL1%琼脂糖溶液内,机械震荡使其分布均匀,置于3.0TMR上扫描。取一组细胞,以3000rp/min离心1min后去上清,置入IVIS荧光成像系统内成像。将一组细胞溶于1mL饱和盐酸溶液中,静止20min,后稀释40倍,送于ICP测定Fe元素含量。

参考文献

[1]Tumor targeting and microenvironment-responsive nanoparticles for gene delivery[J].Shixian Huang,Kun Shao,Yuyang Kuang,Yang Liu,Jianfeng Li,Sai An,Yubo Guo,Haojun Ma,Xi He,Chen Jiang.Biomaterials.2013(21)

[2]Multilayered,core/shell nanoprobes based on magnetic ferric oxide particles and quantum dots for multimodality imaging of breast cancer tumors[J].Qiang Ma,Yuko Nakane,Yuki Mori,Miyuki Hasegawa,Yoshichika Yoshioka,Tomonobu M.Watanabe,Kohsuke Gonda,Noriaki Ohuchi,Takashi Jin.Biomaterials.2012(33)

[3]A multifunctional heptamethine near-infrared dye for cancer theranosis[J].Shenglin Luo,Xu Tan,Qingrong Qi,Qinyuan Guo,Xinze Ran,Lilong Zhang,Erlong Zhang,Yufeng Liang,Lingling Weng,Hu Zheng,Tianmin Cheng,Yongping Su,Chunmeng Shi.Biomaterials.2012

[4]Permeability to macromolecular contrast media quantified by dynamic MRI correlates with tumor tissue assays of vascular endothelial growth factor(VEGF)[J].Clemens C.Cyran,Barbara Sennino,Yanjun Fu,Victor Rogut,David M.Shames,Bundit Chaopathomkul,Michael F.Wendland,Donald M.McDonald,Robert C.Brasch,Hans-Juergen Raatschen.European Journal of Radiology.2011(5)

[5]杨楠楠.被动靶向的磁共振成像及近红外成像双模态纳米探针研究[D].南京大学,2013.