KP-N-NS细胞专用培养基的应用

背景^[1-3]

KP-N-NS细胞专用培养基适用于KP-N-NS细胞各个时期的无菌培养。KP-N-NS细胞专用培养基包含KP-N-NS细胞生长所需的各种物质，不需要额外添加血清和其他成分可直接用于KP-N-NS细胞的体外培养。

KP-N-NS细胞是源自脑转移灶的肾上腺神经母细胞瘤，洗白呈现 上皮细胞样贴壁生长。

KP-N-NS人肾上腺神经母细胞瘤细胞(脑转移)培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

用于神经母细胞瘤中肿瘤恶液质及PLK1抑制剂RO3280的功能研究

神经母细胞瘤中肿瘤恶液质的研究目的:神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见的颅外实体肿瘤,占儿童肿瘤的10%和儿童肿瘤相关死亡的15%。肿瘤恶液质(cancercachexia,CC)是常见的伴随肿瘤发生的多因素综合征,主要表现为体重减轻、骨骼肌减少。大约50%的肿瘤患者的死亡与肿瘤恶液质相关。

方法:1、体内实验:将12只裸鼠随机分为两组,KP-N-NS组6只裸鼠皮下注射KP-N-NS细胞,PBS组6只裸鼠皮下注射等体积PBS;之后监测裸鼠体重及摄食重量,6周后处死存活裸鼠,收集裸鼠骨骼肌、心脏标本,用H&E染色方法观察裸鼠骨骼肌、心肌的变化,用免疫荧光方法检测骨骼肌中肌球蛋白(Myosin)表达水平,用免疫组化方法检测裸鼠骨骼肌中增殖、自噬、泛素化相关蛋白表达水平。

2、体外实验:收集培养过KP-N-NS细胞的培养基作为条件培养基(conditioned medium,CM),用CM(CM组)、Angiogenin(血管生成素)(Angiogenin组)培养C2C12细胞,用正常培养的C2C12细胞作为对照组,观察细胞数量及生存状态。诱导C2C12细胞分化3d,用CM、Angiogenin培养C2C12细胞24h,用免疫荧实验观察C2C12细胞肌管直径变化。用CM培养C2C12细胞15min、30min、1h、24h,提取相应蛋白质,用WesternBlot方法检测增殖、自噬、泛素化相关蛋白表达水平。

参考文献

[1]Haploidentical Stem Cell Transplantation for Refractory/Relapsed Neuroblastoma[J].Toni Illhardt,Jacek Toporski,Tobias Feuchtinger,Dominik Turkiewicz,Heiko-Manuel Teltschik,Martin Ebinger,Carl-Philipp Schwarze,Ursula Holzer,Holger N.Lode,Michael H.Albert,Bernd Gruhn,Christian Urban,Josefina H.Dykes,Oliver Teuffel,Michael Schumm,Rupert Handgretinger,Peter Lang.Biology of Blood and Marrow Transplantation.2018(5)

[2]Teaching the basics of cancer metabolism:Developing antitumor strategies by exploiting the differences between normal and cancer cell metabolism[J].Balaraman Kalyanaraman.Redox Biology.2017

[3]Signal transducer and activator of transcription 3 signaling as a potential target to treat muscle wasting diseases[J].David Sala,Alessandra Sacco.Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabol.2016(3)

[4]STAT3 in the Systemic Inflammation of Cancer Cachexia[J].Teresa A.Zimmers,Melissa L.Fishel,Andrea Bonetto.Seminars in Cell and Developmental Biology.2016

[5]任俊丽.神经母细胞瘤中肿瘤恶液质及PLK1抑制剂RO3280的功能研究[D].苏州大学,2018.