兔抗鼠IGG血清应用

背景^[1-3]

兔抗鼠IGG血清也称兔抗鼠IGG抗血清，是将鼠IGG抗原分子分别以弗氏完全佐剂（油包水溶性抗原分子）或弗氏不完全佐剂，及水剂相结合的剂型免疫注射于兔子等实验动物的不同部位，产生高效价抗体后，经无菌低温分离制成。免疫血清可广泛的应用于医学、生物学的各个学科，特别在临床免疫测定和免疫病理的诊断中更是必备之材。

抗血清（antiserum）是一种含有多克隆抗体的血清。通过注射抗血清可以传递被动免疫（passive immunity）治疗许多疾病。唯一能够治疗埃博拉病毒患者的方法就是通过注射前一个患者的抗血清到体内。

抗原的免疫方案根据其性质不同而异。

以制备兔抗鼠IGG抗血清为例。

（1）抗原乳化：称取羊毛脂10g于研钵中，、逐滴加入石腊油40ml，逐滴研磨，高压灭菌后备用。将上述不完全福氏佐剂预热至60℃，取3ml，逐滴加入0.5ml BCG（75mg/ml），继续加入2.5ml人C3蛋白（2.4mg/ml），边滴入边研磨，直至达到“油包水”状态。

（2）动物免疫：选取健康新西兰兔（3Kg左右），消毒局部皮肤，用1ml注射器吸取1ml乳化抗原，于兔每只脚掌皮下注入0.5ml。间隔2周后，将1ml乳化抗原多点（5－10点）注入兔腘窝及背部皮下。间隔2周后，在1周内分别3次通过兔耳静脉注射2.4mg/ml人C3蛋白液（分别为0.1ml、0.3ml、0.5ml），间隔1周后采用双向免疫扩散测定抗血清效价，当效价达到1：16以上即可放血。

（3）放血：可采用颈动脉放血法和心脏采血法。

（4）鉴定：采用双向免疫扩散或ELISA测定抗血清效价。

（5）保存：抗血清收获后，加1/万硫柳汞或1/万的叠氮钠防腐，或加入等量的中性甘油，分装小瓶，置-20℃以下的低温保存，数月至数年内抗体效价无明显变化。注意避免反复冻融。也可将抗血清冷冻干燥后保存。

应用^[4]

用于高危型人乳头瘤病毒16型免疫胶体金诊断试纸条的研制

利用基因克隆技术构建和表达HPV16E6基因,用镍柱亲和层析纯化HPV16E6蛋白;用HPV16E6蛋白免疫家兔,制备抗HPV16E6蛋白多克隆抗体;用HPV16E6蛋白免疫雌性Balb/C小鼠,用杂交瘤技术建立抗HPV16E6蛋白的单抗杂交瘤细胞株,用体外诱生法制备大量的单抗腹水;用鼠源单克隆抗体作为抗原免疫家兔制备高效价的兔抗鼠IgG即二抗;用获得的单克隆抗体、多克隆抗体和二抗建立了高危型人乳头瘤病毒HPV16型的胶体金免疫层析快速诊断方法。

结果:利用基因克隆技术成功构建含HPV16E6基因原核表达质粒的工程菌pET-28a(+)-HPV16E6-BL21 Star-DE3 PlysS,DNA测序正确,Western Blotting鉴定诱导表达出的蛋白为HPV16E6蛋白;兔抗HPV16E6蛋白多抗的效价高达1:256000;细胞融合率达93.2%,筛选出阳性克隆11孔,两次有限稀释法克隆化培养,筛选出了6株能稳定分泌特异性抗HPV16E6蛋白单克抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F9、2F10、3C5、3C6、4D4、5B10。

免疫细胞化学检测时这些单抗仅与CaSki细胞(含HPV16型)发生特异性反应,而不与其Hela细胞(含HPV18型)发生反应,免疫组织化学检测时这些单抗只与宫颈癌鳞癌组织(含HPV16型)发生反应,而不与宫颈癌腺癌(含HPV18型)发生反应;间接ELISA方法检测兔抗鼠单抗IgG的多克隆抗体血清的效价高达1:256000;制备了30nm的胶体金颗粒,单克隆抗体(4D4株)的实际标记量为6ug/ml。

参考文献

[1]Real-time PCR-based fluorescent assay for quantitation of human papillomavirus types 6,11,16,and 18[J].Ruth Ann Tucker,Elizabeth R.Unger,Brian P.Holloway,David C.Swan.Molecular Diagnosis.2001(1)

[2]Surrogate Biomarkers of HPV Infection in Cervical Neoplasia Screening and Diagnosis[J].Jeffrey T.Keating,Tan Ince,Christopher P.Crum.Advances in Anatomic Pathology.2001(2)

[3]Human Papillomavirus Detection by the Hybrid Capture II Assay:A Reliable Test to Select Women With Normal Cervical Smears at Risk for Developing Cervical Lesions[J].Christine Clavel,Marie Masure,Marc Levert,Isabelle Putaud,Christelle Mangeonjean,Marianne Lorenzato,Pierre Nazeyrollas,RenéGabriel,Christian Quereux,Philippe Birembaut.Diagnostic Molecular Pathology.2000(3)

[4]胡仁建.高危型人乳头瘤病毒16型免疫胶体金诊断试纸条的研制[D].重庆理工大学,2009.