人单核细胞分离液试剂盒的应用

背景^[1-3]

人单核细胞分离液试剂盒分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法，主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作，且使用通常的实验设备即可完成。

单核细胞（monocytes）是血液中的血细胞，也是体积的白细胞，是机体防御系统的一个重要组成部分。单核细胞来源于骨髓中的造血干细胞，并在骨髓中发育，当它们从骨髓进入血液时仍然是尚未成熟的细胞。目前认为它是巨噬细胞和树突状细胞的前身，具有明显的变形运动，能吞噬、清除受伤、衰老的细胞及其碎片。

单核细胞还参与免疫反应，在吞噬抗原后将所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，诱导淋巴细胞的特异性免疫性反应。单核细胞也是对付细胞内致病细菌和寄生虫的主要细胞防卫系统，还具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力。与其他血细胞比较，单核细胞内含有更多的非特异性脂酶，并且具有更强的吞噬作用。当机体发生炎症或其他疾病都可引起单核细胞总数百分比发生变化，因此检查单核细胞计数成为辅助诊断的一种重要方法。

操作方法（操作全过程应在20-25度环境下进行）

1在10ml或15ml玻璃离心管中依次小心加入A、D 2种液体各2ml,制成梯度界面（各液面分层一定清晰）。

2取1ml肝素抗凝血与全血及组织匀浆稀释液（或胎牛血清或人血清悬起匀浆的细胞1X107/ml）1：1混合后于D液上重叠，以1000-1500rpm/min离心40min，在血浆与D液的界面为单核细胞层.（提取率约为80%）。

3吸出单核细胞层以细胞洗涤液洗涤三次备用。

细胞放入含细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）4-5毫升的试管中，充分混匀后，以1500-2000转/分离心10-30分钟。沉淀经反复洗2次即得所需细胞。

应用^[4][5]

用于卡他莫拉菌UspA1来源重组蛋白rD-7对人单核细胞分化及DC成熟的影响研究

卡他莫拉菌感染后,大量单核细胞和树突状细胞被趋化因子募集至炎性位点。单核细胞以及DC都是高度异质性细胞群体,单核细胞可以被病原菌及其毒力分子诱导分化成为抗炎性的M1型巨噬细胞或者抑炎性的M2型巨噬细胞,而DC的成熟也受到微环境中病原菌及其他因素的影响,这些因素分别促进或者抑制DC的成熟。

单核.巨噬细胞作为固有性免疫应答的一线哨兵细胞,而DC处于调控固有性和适应性免疫应答的核心环节,卡他莫拉菌对两群细胞的调节可能直接或间接的影响、甚至决定感染后肺部的免疫反应结果。

研究卡他莫拉菌外膜蛋白UspA1来源重组蛋白rD-7对单核细胞分化的影响及其机制。

方法：1.重组蛋白rD-7、rD-7/D和r6-8的制备与鉴定。通过pQE30表达系统制备重组蛋白rD-7及对照蛋白(rD-7/D和r6-8),Ni-NTA亲和层析法分离重组蛋白。采用抗His标签抗体和可溶性的CEACAM1-Fc通过Western blot实验验证rD-7的特异性及功能。多粘菌素B去除蛋白样品中的内毒素,0.2μm滤器过滤蛋白样本除菌,测定蛋白样品中内毒素含量低于1.0EU/μg。

2. 蛋白酶K消化处理重组蛋白rD-7和rD-7/D。采用终浓度为200μg/ml无菌蛋白酶K在37℃水浴条件下,消化重组蛋白rD-7和rD-7/D3小时。消化后的蛋白样本置于95℃水浴孵育1小时灭活蛋白酶K,SDS-PAGE检测rD-7和rD-7/D的消化结果。

3. 3.健康人外周血CD14+/CD15+细胞的分离和纯化。采集健康志愿者外周静脉血并收集于无菌采集袋中,密度梯度离心分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),采用免疫磁珠分选法阳性分选CD14+单核细胞和CD15+细胞。

参考文献

[1]Prognostic values of VEGF and IL-8 in malignant pleural effusion in patients with lung cancer[J] . Daye Cheng,Hong Kong,Yunhui Li.  Biomarkers . 2013 (5)

[2]HLA-DR expression as a biomarker of inflammation for multicenter clinical trials of ocular surface disease[J] . Seth P. Epstein,Neha Gadaria-Rathod,Yi Wei,Maureen G. Maguire,Penny A. Asbell.  Experimental Eye Research . 2013

[3]Association of IL-8 gene polymorphisms with non small cell lung cancer in Tunisia: A case control study[J] . Ahlem Rafrafi,Besma Chahed,Safa Kaabachi,Wajih Kaabachi,Haifa Maalmi,Kamel Hamzaoui,Fay?al Haj Sassi.  Human Immunology . 2013

[4]Beyond pattern recognition: NOD-like receptors in dendritic cells[J] . Jayendra Kumar Krishnaswamy,Thach Chu,Stephanie C. Eisenbarth.  Trends in Immunology . 2013 (5)

[5]解奇. 卡他莫拉菌UspA1来源重组蛋白rD-7对人单核细胞分化及DC成熟的影响研究[D].山东大学,2014.