人总胆汁酸(TBA)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人总胆汁酸(TBA)ELISA KIT采用双抗体夹心ELISA法。用抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的抗原会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗体与结合在包被抗体上的抗原结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，抗原浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中指标的浓度。

操作步骤

1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

血清总胆汁酸（TBA）是肝脏分泌到胆汁中最多的有机酸，肝功能受损时，胆汁酸代谢发生了变化，血中TBA很易升高，因此TBA已被认为是肝实质性损伤的灵敏指标。可以作为判断肝胆系统正常与否的重要信息。

应用^[4][5]

用于硫普罗宁对环孢素A肝毒性的保护的实验研究

研究环孢素A（CsA）肝毒性的作用机制及硫普罗宁对其肝毒性的保护作用。方法：实验分成四组：空自组，CsA组，Tio组（环孢素A+硫普罗宁），Ver组（环孢素A+维拉帕米），分别用环孢素A，硫普罗宁，维拉帕米灌胃，每日一次，剂量分别为25mg/kg，250mg/kg，10mg/kg，检测用药前、用药一周、二周时血清两氨酸转移酶，总蛋白，白蛋白，总胆汁酸，总胆红素，直接胆红素等生化指标以及血清超氧化物歧化酶，丙二醛，同时测定肝组织中丙二醛，谷胱甘肽含量和细胞色素P4503A4活性，并观察肝脏显微及超微结构改变。结果：CsA应用后有明显的肝脏毒性，血清生化主要表现为丙氨酸转移酶、总胆汁酸、胆红素升高，淤胆是最显著表现；蛋白下降，尤以白蛋白为主，说明蛋白合成减少。CsA引起SOD含量下降，脂质过氧化，谷胱甘肽衰竭，P4503A4活性降低；硫普罗宁有降低转氨酶作用（P＜0.01），亦有降低总胆汁酸（P＜0.01），总胆红素作用（P＜0.01）；硫普罗宁能改善SOD活力（P＜0.01），对抗脂质过氧化（P=0.051）；维拉帕米对转氨酶没有影响，有一定的降低总胆汁酸作用（P＜0.05），对胆红素影响小。光镜观察，CsA可引起肝细胞空泡变性，灶性、大片坏死，肝小叶结构破坏，汇管区炎细胞浸润，应用硫普罗宁后坏死区明显缩小肩变减轻，电镜观察，CsA的毒性主要表现为线粒体肿胀、空泡化，内质网显著扩张，线粒体膜、核膜模糊或消失，应用硫普罗宁后线粒体、内质网显示明显好于CsA组，核膜、线粒体膜基本成正常结构。结论：CsA有明显的肝毒性，作用机制复杂，硫普罗宁对其肝损害有一定保护作用

参考文献

[1]Human liver cytochrome P4503A biotransformation of the cyclosporin derivative SDZ IMM 125.Vickers AE,Meyer E,Dannecker R,et al.Drug Metabolism and Disposition.1995

[2]Sulfur amino acid metabolism in cystinuria:A biochemical and clinical study of patients.Martensson J,Denneberg T,Lindell A,et al.Kidney International.1990

[3]Drug interactions with grapefruit juice:Extent,probable mechanism,and clinical relevance.Fuhr U.Drug Safety.1998

[4]Drug interactions with grapefruit juice:Extent,probable mechanism,and clinical relevance.Fuhr U.Drug Safety.1998

[5]陈晓宁.硫普罗宁对环孢素A肝毒性的保护的实验研究[D].南京医科大学,2001.