人糖磷脂酰肌醇(GPI)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人糖磷脂酰肌醇(GPI)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中人糖磷脂酰肌醇(GPI)水平。用纯化的人糖磷脂酰肌醇(GPI)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人糖磷脂酰肌醇(GPI)，再与HRP标记的人糖磷脂酰肌醇(GPI)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人糖磷脂酰肌醇(GPI)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人糖磷脂酰肌醇(GPI)浓度。

GPI的核心结构由乙醇胺磷酸盐、三个甘露糖苷、葡糖胺以及纤维醇磷脂组成。一般来说，任何蛋白的GPI锚都不是同质的，而是一系列同系物的混合体。GPI锚定蛋白的C末端是通过乙醇胺磷酸盐桥接于核心聚糖上，该结构高度保守，另有一个磷脂结构将GPI锚连接在细胞膜上。核心聚糖可以被多种侧链所修饰，比如乙醇胺磷酸盐基团，甘露糖，半乳糖，唾液酸或者其他糖基。一些复杂的侧链结构如N-乙酰氨基半乳糖在哺乳动物和原虫中都发现。另外，像1,2-二酰基甘油，1-烷基-2酰基甘油，单酰基甘油以及神经酰胺都可作为GPI锚结构的类脂成分。而且某些GPI锚定蛋白的酰基取代基也可能是功能结构的一部分。这些酰基基团通过抑制磷酸盐的形成来使GPI锚不受PI-PLC（phosphat-idylinosito-l specific phospholipase C）的影响。

应用^[4][5]

用于GPI锚定型CD80-CD58融合基因在真核细胞中的表达、纯化及其抗肿瘤作用研究

机体抗肿瘤的免疫必须依赖于肿瘤细胞的抗原被机体免疫系统识别，方能激活。但人类肿瘤免疫原性弱，且抗原呈递中存在多个环节缺陷，使肿瘤逃避机体免疫识别。因此，若能将免疫相关基因导入肿瘤细胞制备肿瘤疫苗，可增强肿瘤细胞抗原性以及抗体对肿瘤抗原的识别和呈递能力，增强机体抗肿瘤免疫能力。

CD80是表达于活化的B细胞、巨噬细胞、树突细胞、T细胞和NK细胞等有抗原呈递作用的细胞上的糖蛋白，与其配体CD28结合，在T细胞活化中起协同刺激作用。但是目前研究表明，除少数的B淋巴瘤外，肿瘤细胞表面并不表达CD80分子。不表达CD80分子的肿瘤细胞即使有免疫原性，仍不能有效地诱导T细胞活化，甚至产生特异的无反应性。细胞表达CD80分子后具有免疫原性，被CD8+T前体CTL细胞识别时，肿瘤抗原MHC-Ⅰ类分子复合物提供信号，而CD80分子通过与T细胞表面的CD28作用提供第二信号。

随着人们对糖基化磷脂酰肌醇（Glycosyl phospharidyl inositol，GPI）锚定信号认识的不断深入，人们开始利用GPI锚将蛋白锚定于细胞表面而发挥肿瘤疫苗的作用。GPI锚定蛋白没有跨膜区和胞内部分，不跨越细胞膜脂质双分子层，只通过其羧基末端的GPI结构锚定于细胞膜上。当GPI锚定蛋白与细胞共同孵育时，可以自动整合到细胞膜表面，并可以保持与其天然配体结合的能力。利用GPI的上述结构功能特点及CD80的抗肿瘤功能，将CD58的羧基末端肽链编码序列和CD80的胞外编码序列进行体外基因重组（CD58的羧基末端肽链含ω位点，其表达产物为GPI锚定蛋白），接着在真核表达体系中表达，通过纯化后得到GPI锚定形式的CD80。

参考文献

[1]B7-1-HSA(CD80-CD24),a recombinant hybrid costimulatory molecule retains ligand binding and costimulatory functions[J].Yi-Chong Wang,Rangaiah Sashidharamurthy,Shanmugam Nagarajan,Periasamy Selvaraj.Immunology Letters.2006(2)

[2]A Model for CD2/CD58-Mediated Adhesion Strengthening[J].Jin-Yu Shao,Yan Yu,Michael L.Dustin.Annals of Biomedical Engineering.2005(4)

[3]In vivo tumor co-transfection with superantigen and CD80 induces systemic immunity without tolerance and prolongs survival in mice with hepatocellular carcinoma[J].Zeng-Shan Li,Xin-Wei Yang,Zheng Chen,Hai-Long Dong,Jing Ye,Ping Qu,Shao-Ying Lu,Xiu-Min Zhang,Yan-Fang Sui.Cancer Biology&Therapy.2004(7)

[4]Porcine CD58:cDNA cloning and molecular dissection of the porcine CD58–human CD2 interface[J].Angélique Brossay,Florent Hubé,Thierry Moreau,Pierre Bardos,HervéWatier.Biochemical and Biophysical Research Communications.2003(4)

[5]刘煜.GPI锚定型CD80-CD58融合基因在真核细胞中的表达、纯化及其抗肿瘤作用研究[D].军医大学,2007.