PCR产物纯化回收试剂盒

概述^[1]

本试剂盒适用于从 PCR 反应液或各种酶促反应液中纯化回收 DNA 片段。该试剂盒采用特殊的吸附膜，能够有选择性地吸附核酸分子，去除反应液中的各种酶蛋白、引物、dNTP 等，得到高质量的 DNA 纯化产物，可直接用于酶切、测序等后续的分子生物学试验。本试剂盒具有以下特点：

1.适用范围广，回收效率高。

2.操作简单快速，整个回收过程仅需 5 分钟左右。

3.洗脱效率高，洗脱体积最小可低至 15μl。 

试剂盒组成^[1]

保存方法及注意事项^[1]

本试剂盒在室温（15-25℃）干燥保存，有效期见包装。Buffer B3 中含有刺激性的化合物，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。 

标准抽提步骤^[1]

自备材料：水浴锅、小型高速离心机（离心力≥12,000 ×g）、1.5 mL 离心管、无水乙醇、异丙醇等。按瓶身标签说明在 Wash Solution 中加入相应量的无水乙醇（乙醇终浓度为 80%），混匀后在瓶身做好标记。于室温密封保存。按瓶身标签说明在 Buffer B3 中加入相应屋的异丙醇（异丙醇终浓度为 20%），混匀后在瓶身做好标记。密封于室温保存。每次使用前请检查 Buffer B3 是否出现沉淀，如有沉淀，请于 37℃溶解沉淀，待冷却至室温后使用。

1. 将 PCR 反应液或酶促反应液移至一干净的 1.5 mL 离心管中，加入 3 倍体积的Buffer B3，充分混匀。首次使用前请先检査是否已加入适置的异丙醇。若反应液体积过小，可用 TE 或水补足至 100μl，然后再加入 300μl Buffer B3。

2. 将混合液全部移入吸附柱，8,000 ×g 离心 30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。如果体系总体积大于 750μl，则每次使用 750μl，多次上柱。将滤出液再次加入吸附柱中再次过柱，可以进一步提高 DNA 回收率。

3. 向吸附柱中加入 500μl Wash Solution， 9,000 ×g 离心 30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。Wash Solution 首次使用前请检査是否已加入正确量的无水乙醇。

4. 重复步骤 3 一次。

5. 将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000 ×g 离心 1 min。此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。

6. 在吸附膜中央加入15-40μl Elution Buffer，室温静置l-2min，9,000 ×g离心1 min。将所得到的 DNA 溶液罝于-20°C 保存或用于后续试验。

Elution Buffer 为 2.5mM Tris-HCI，pH 8.5，可以用 TE 或水（pH >7.0）代替。将 Elution Buffer 预热至 60°C 可以进一步提高得率。如果片段>4kb，在 37-60°C 温浴 2 分钟可以显著提高得率。请勿使用小于 15μl 的洗脱液进行洗脱。

常见问题解答^[1]

1. PCR 产物回收效率较低或者未回收到目的片段

A. Wash Solution 中未加入正确量的无水乙醇。

B. 提高 Buffer B3 的相对浓度，增加 DNA 与吸附膜的作用时间（静罝时间），在一定程度上可以提高回收率。

C. 如果纯化的片段长度大于 4 kb 或者目的片段含量较少，可将洗脱液再次加入吸附柱进行洗脱，以提高回收效率。

D. 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜的中心部位，以完全覆盖硅胶膜的表面，达到的洗脱效率。

E. 洗脱液不合适：洗脱缓冲液的 pH 值对洗脱效率有影响，如果使用水进行洗脱，请确保其 pH 值>7.0，pH 值过低可能导致低洗脱效率。

F. 洗脱时将洗脱液预热至 60°C 后使用，有利于提高洗脱效率。

G. 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也有影响。洗脱时放置 1min 可达到较好的效果。

2. 回收的 PCR 产物进行后续酶切或者连接效率低

A. 若洗脱产物中含有残留的乙醇会影响酶切。可将空柱离心后的吸附柱开盖室温晾干2-5min，有助于残留的乙醇挥发完全。

B. 盐分的残留。请确保使用 Wash Solution 洗涤两次，每次 500μl 沿管壁加入，有助于彻底去除管壁上的盐份。

C. 回收后的 PCR 产物在反复冻溶的情况下，会加速末端 A 和整个 PCR 产物的断裂，从而造成与 T 载体的分子数比例，有助于提高连接效率。

3. 回收的片段为什么电泳上样会漂起来？

A. 主要原因是纯化过程中的乙醇没有去除干净。可将离心后的吸附柱开盖室温干燥 2-5min，有助于残留的乙醇挥发完全。

主要参考资料

[1] 柱式 PCR 产物纯化试剂盒产品说明书